Summary
Это видео демонстрирует протокол для выделения ДНК из фиксированных формалином парафин материала. Это многодневных процедура, при которой ткань разделы deparaffinized с ксилол, регидратации с этанолом и обрабатывают протеиназы К, чтобы очистить и изолировать ДНК для последующего гена или конкретной генома анализа.
Protocol
Discussion
Биопсии или хирургическим путем вырезали ткани для гистологического анализа и диагностики часто фиксированных формалином и залитые парафином (FFPE) для длительного хранения. С ростом интереса к пониманию генетической основы болезни, умение извлекать ДНК из этих образцов представляет бесценный источник диагностического материала, который может быть использован для геномного анализа и поступательное исследований. Исторически FFPE образцы не считается жизнеспособным источником для молекулярного анализа, как нуклеиновые кислоты могут быть сильно изменены белково-нуклеиновых и белок-белковые сшивки 6. Тем не менее, открытие, что протеазы пищеварения релизы фрагментирован нуклеиновых кислот, которые подходят для последующих анализов, включая ПЦР, массив CGH, последовательность и метилирования профилирование, позволяет использовать эти ценные образцы для генетического анализа 6.
Экстракции ДНК из парафиновых срезах тканей является надежной процедурой, которая опирается на дифференциальные растворимости для очистки ДНК. Извлеченные качества ДНК и количество и успех последующей амплификации ДНК зависит от ряда параметров до, во время и после экстракции. Они включают, но не ограничиваются: тип и количество ткани, тип фиксатора используется для сохранения ткани, длительность фиксации, возраст блок парафина и условий хранения, а также длину желаемого сегмента ДНК, чтобы быть усиливается 1,7. Удаление парафина из тканей является наиболее важным шагом для успешного извлечения как нерастворенных парафина приводит к ухудшению качества образца и ингибирование ПЦР.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Лам для их оценки и критика этого видео и статьи. Работа выполнена при поддержке за счет средств канадского института исследований в области здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | VWR international | CABDH6216- 4 | - |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | - |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet International | C0160-B | - |
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
||
| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher Scientific | BP1750I-400 | - |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher Scientific | BP1752I-400 | - |
| RNase A | Roche Group | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
||
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | - | - |
References
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. oseph, R, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
- Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
- Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
