Summary
Vi presenterar våra optimerade hög genomströmning nucleofection protokoll som ett effektivt sätt att transfecting primära humana monocyt-härledda dendritiska celler med antingen plasmid DNA eller siRNA utan att orsaka cellmognaden. Vi ger ytterligare bevis för framgångsrik siRNA tysta riktade genen Rig-i på både mRNA-och proteinnivåer.
Abstract
Dendritiska celler (DC) kan anses vara vaktposter av immunsystemet, som spelar en avgörande roll i initiering och svar på infektion 1. Upptäckt av patogena antigen genom naiv Utvecklingsländerna är via receptorer mönsterigenkänning (PRRS) som kan känna igen specifika bevarade strukturer som kallas patogen-associerade molekylära mönster (PAMPS). Upptäckt av PAMPs av utvecklingsländernas utlöser en intracellulär signalering kaskad resulterar i aktivering och omvandling till mogna utvecklingsländer. Denna process är normalt kännetecknas av produktion av typ 1-interferon tillsammans med andra proinflammatoriska cytokiner, uppreglering av markörer på cellytan som MHCII och CD86 och migration av den mogna DC till dränering lymfkörtlar, där interaktionen med T-celler initierar det adaptiva immunsvaret 2, 3. Således fick utvecklingsländer länk det medfödda och adaptiva immunsystem.
Förmågan att dissekera den molekylära nätverk som ligger bakom DC svar på olika patogener är avgörande för en bättre förståelse av regleringen av dessa signalvägar och deras inducerade gener. Det bör också bidra till att underlätta utvecklingen av DC-baserade vacciner mot infektionssjukdomar och tumörer. Emellertid har denna forskningsinriktning allvarligt hindras av svårigheten att transfecting primära utvecklingsländernas 4.
Virus transduktion metoder, såsom Lentiviral systemet används normalt, men bär många begränsningar, såsom komplexitet och biologiskt farliga risker (med tillhörande kostnader) 5,6,7,8. Dessutom ökar leveransen av gener produkter immunogeniciteten av dessa transduced utvecklingsländernas 9,10,11,12. Elektroporation har använts med blandat resultat 13,14,15, men vi är de första att rapportera användningen av en hög genomströmning transfektion protokollet och slutgiltigt visa sin nytta.
I denna rapport sammanfattar vi en optimerad kommersiella protokoll för hög genomströmning transfektion av människans primära utvecklingsländerna, med begränsad celltoxicitet och avsaknad av DC mognad 16. Transfektion effektivitet (av GFP plasmid) och cellviabiliteten var mer än 50% respektive 70%. FACS analys etablerade avsaknad av ökningen uttryck för mognad markörerna CD86 och MHCII i transfekterade celler, medan QRT-PCR visade inga uppreglering av IFNβ. Med hjälp av denna elektroporation protokoll ger vi belägg för framgångsrik transfektion av DCS med siRNA och effektivt slå ner riktade gen RIG-I, en nyckel virus erkännande receptorn 16,17, både på mRNA-och proteinnivåer.
Protocol
1. Programmera Amaxa 96 bra transfer Nucleofector
- Öppna en ny parameter fil.
- Välj antal brunnar du kommer att använda för vanliga transfektion genom att dra markören över 96 brunnar diagram. Använd minst tre brunnar till poolen för varje experimentell prov.
- Ingång programkoden: i part1 välja "FF" och i part2 välj '168 'från rullgardinsmenyer
- Från Lösning rutan välj monocyter, mänskliga "
- Under kontroll som tillval välja "standard".
- Klicka på Verkställ.
- För att inkludera en no-transfektion kontroll, välj ytterligare brunnar i diagrammet efter behov och välj sedan "Nej Program Control" från Control och klicka på Verkställ.
- Välj eventuellt återstående oanvända brunnar på tallriken diagrammet och klicka på odefiniera.
2. Förbered utvecklingsländer för transfektion
- Allt arbete bör utföras under sterila förhållanden i en cellkultur huva om möjligt. Förbered nucleofection lösningen genom att tillsätta 96-bra komplement till mänskliga monocyte 96-bra Nucleofector lösning i förhållandet på 450 till 2025. Blanda och låt värmas upp till rumstemperatur. Du behöver 20μl av nucleofection lösning per brunn. Gör en mer än 10% för att möjliggöra för pipettering fel.
- Placera antal nucleocuvette moduler du behöver i nucleocuvette plattan i rätt riktning, dvs sätter in den första i att raderna 1 och 2.
- Bestäm antalet utvecklingsländerna som behövs för ditt experiment beräkning på 500 tusen celler per brunn och pellets genom att centrifugera på 400g för 10min. Ta försiktigt bort supernatanten.
- Resuspendera cellerna i nucleofection lösningen genom att försiktigt pipettera upp och ned några gånger.
- Dela upp rätt volym återsuspenderad celler i eppendorfs märkt för en viss behandling, t.ex. GLO och RIG-I.
- Lägg 0.25μg siRNA per 500 tusen celler och blanda genom att pipettera. Använda icke-inriktning siRNA i no-transfektion kontrollprov.
- Pipettera 20μl av ovanstående blandningar i nucleocuvette moduler, enligt dina experimentella layout, är att se till att vätskan som levereras till botten av brunnen.
- Täck nucleocuvette plattan med locket och tryck på plattan på en hård yta ett par gånger för att se luftbubblor.
3. Transfektera utvecklingsländer
- Sätt in plattan i Nucleofector 96-bra transfer fack, klicka på Ladda upp och starta.
- Följ utvecklingen av transfektion process på bärbar skärm, ett svart kors på grön bakgrund betyder en lyckad transfektion i den väl, medan en svart bar på en röd bakgrund betyder att det misslyckades.
- Efter avslutad transfektion processen, ta bort plattan och tillsätt 80μl av DC-tillväxten i varje brunn med hjälp av en flerkanalspipett.
- Inkubera plattan i 10 minuter vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Överför 100μl volymen från nucleocuvettes i matrisen provrör innehållande 100μl av förvärmda DC tillväxt medium, hålla rätt orientering.
- Ta bort och kasta de rör där transfektion inte skedde.
- Inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2 för 24h eller annat önskat tidsintervall.
4. Infektera celler med Newcastlesjukans virus
- Ta bort matris rör från inkubatorn för cellkulturen huven och rör pool för varje experimentell provet i eppendorfs
- Pellets cellerna försiktigt genom att snurra på en bordsskiva Centrifugera i 5 minuter och ta bort supernatanten.
- Resuspendera cellerna i serum-fri tillväxt medium som innehåller Newcastlesjukans virus på ett MOI 1 och inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2 för 45 min, med eppendorfs löst täckt i ett sterilt sätt.
- Tillsätt 900μl DC tillväxt medium, och åter inkubera i 8-10 h.
5. Harvest celler
- Pellets celler genom att snurra eppendorfs i en bordsskiva centrifug och avlägsna supernatanten.
- Harvest celler för RNA eller protein extraktion enligt ditt protokoll.
6. Representativa resultat:
Med vår optimerat protokoll vi transfekterade DC med Rigi inriktning siRNA för 24 h och sedan smittade cellerna med Newcastlesjukans virus (ett paramyxovirus detekteras av Rig-i) för att stimulera interferon svaret väg. Genom QRT-PCR-analys visade vi slå ner av genen med 75% vid transkriptionen nivå. Vi observerade också en liknande minskning i uttryck av IFNβ, som är ett nedströms effektor av RIG-I i IFN signalering kaskad. Vidare konstaterade vi att uttrycket av IFNβ i icke-infekterade, kontroll-transfekterade cellerna var inte upptäckas medan den för MXA, en IFNβ nedströms svar gen, var minimal (Figur 1A).
En andra transfektion av DCS med Rigi inriktning siRNA utfördes med hjälp av tillräckligt många celler att inkludera Western blot-analys. OmRT-PCR-resultat var jämförbara med vad vi såg tidigare (62% respektive 66% slå ner av RIG-I och IFNβ uttryck respektive) (Figur 1B), sonderade Western blot för RIG-Jag visade att uttrycket av denna gen hade helt blockerad (Figur 1C).
Figur 1. (A) MoDCs var transfekterade med antingen siRNA riktade RIG-I eller ospecifik GLO siRNA och effekten på uttrycket av RIG-I IFNβ och MXA bestäms av QRT-PCR. Den transfektion protokoll som används en monocyte-specifik buffert och nucleoporation programmet FF168 (Lonza Walkersville Inc.) Efter inkubering i 24 timmar, var transfekterade cellerna antingen infekterade med Newcastlesjukans virus (+) eller vänster oinfekterade (-). Efter ytterligare inkubation i 10 timmar, var cellerna skördas och RNA extraheras Avskrift värden motsvarar resultaten från två replikera experiment. Taget från Bowles et al 16. (B) MoDCs från en annan lättcellsskikt som används för Figur 1A åter transfekterade med antingen Rig-i-inriktning siRNA eller ospecifika GLO siRNA med samma transfektion protokoll som ovan. En ytterligare kontroll med hjälp av untransfected MoDCs införlivades med experimentet. Efter en 24 h inkubering alla celler var infekterade med Newcastlesjukans virus och inkuberas i ytterligare 10 timmar innan de skördas för både RNA och protein extraktion. Avskrift nivåer av RIG-I IFNβ och MXA som bestäms av QRT-PCR utgör resultaten från två replikera experiment. Taget från Bowles et al 16. (C) Lysates från celler som beskrivs i figur 1B ovan analyserades med Western blot. Lanes 1 och 2, lysates från untransfected celler; körfält 3 och 4, lysates från GLO transfekterade siRNA celler; körfält 5 och 6, lysates från celler transfekterade med Rig-i-inriktning siRNA. Proverna sonderade för RIG-I och även GAPDH (som Lastkontroll) och kördes i två exemplar. Taget från Bowles et al 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effektiv transfektion av naiva primära dendritiska celler är viktig för hög genomströmning analys och reverse engineering av cellulära inflammatoriska vägar i denna nyckel cellen förmedla det medfödda-adaptiva immunförsvaret övergången. De flesta utredarna tycker att dessa celler är svåra att transfektera både effektivt och utan det transfektion förfarande förmå cellmognaden när man använder vanliga transfektion tekniker. Vi undersökte om dessa begränsningar kan övervinnas genom hög kapacitet protokoll optimering med hjälp av en samtidig och oberoende 96-såväl kommersiella kärnkraft transfektion systemet (Lonza).
Med fluorescerande aktiverad cell sortering (FACS), mätte vi en GFP-uttryckande plasmid som markör för transfektion effektivitet och CD86 och MHCII immunreaktivitet som en avläsning av cellens mognad. En rad experiment utvärdera buffertar och program elektroporation slutligen identifierat förhållanden som visar> 50% transfektion samt en avsaknad av ökad mognad markörer.
För att ytterligare undersöka eventuella aktivering av DCS av nucleofection process vi analyserat uttrycket nivåer av IFNβ och dess efterföljande svar gen MXA på mRNA nivå. MXA uttryck är extremt känsligt för IFNβ produktionen och kan användas som biologiska testsystem för att upptäcka mycket låga nivåer av den cytokine18. Genom QRT-PCR-analys såg vi ingen mätbar IFNβ uttryck men fick se några uppreglering av MXA vilket indikerar ovan baslinjen IFNβ induktion. Men denna minimala uppreglering av MXA i icke-infekterade, kontroll-transfekterade cellerna var försumbar jämfört med den som följer av virus-medierad stimulering av IFNβ signalering kaskad (Figur 1A) och bekräftade att vi framgångsrikt skulle kunna använda vårt nucleoporation protokollet för att transfektera utvecklingsländer utan att aktivera dem till någon betydande nivå.
Nyttan av våra optimerat protokoll bekräftades av Western blot-analys. Transfektion av DCS med siRNA riktade RIG-Jag orsakade en total förlust av detekterbara Rig-i protein (Figur 1C). Vi bör notera att för en framgångsrik störning av andra gener, som används mängden siRNA och längd transfektion tid kan behöva optimeras.
Såvitt vi vet kan detta arbete för första gången design av hög genomströmning förlust-av-funktion studier i primära mänskliga utvecklingsländerna, och därmed lösa ett svårt hinder för forskning inom detta område. Detta bör ge nya möjligheter för studier av DC-signalering och kan bidra till framsteg i utvecklingen av DC-baserad immunterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Projektet fick stöd av NIH NIAID Kontrakt nr HHSN2662000500021C. Vi tackar Ming Chen för hans tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza Inc. | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza Inc. | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
- Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
- Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
- Aicher, Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
- Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
- Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
- Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
- Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
- Roth, Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
- Tendeloo, V. F. V. an Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
- Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
- Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
- Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
- Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
- Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).
