Summary
Presentamos nuestra optimizado de alto rendimiento protocolo nucleofection como una forma eficiente de la transfección de primaria monocitos humanos derivados de células dendríticas, ya sea con el ADN de plásmido o siRNA sin causar la maduración celular. Nos proporcionan evidencia adicional para silenciar siRNA éxito de gen diana RIG-I tanto en el mRNA y los niveles de proteína.
Abstract
Las células dendríticas (DC) se puede considerar centinelas del sistema inmunitario que juegan un papel crítico en la iniciación y respuesta a la infección 1. La detección de antígenos patogénicos por los países en desarrollo ingenuo es a través de los receptores de reconocimiento de patrones (RRP), que son capaces de reconocer estructuras específicas de conservación conocido como patógeno de patrones moleculares asociados (PAMP). La detección de PAMP por los países en desarrollo desencadena una cascada de señalización intracelular que resulta en su activación y transformación de los países en desarrollo maduro. Este proceso se caracteriza típicamente por la producción de interferón tipo 1, junto con otras citocinas proinflamatorias, la regulación positiva de los marcadores de superficie celular, como MHCII y CD86 y la migración de las DC maduras a los ganglios linfáticos de drenaje, donde la interacción con las células T se inicia la respuesta inmune adaptativa 2, 3. Por lo tanto, los países en desarrollo enlace del sistema inmune innato y adaptativo.
La capacidad de diseccionar las redes moleculares que subyacen a la respuesta de DC a varios patógenos es fundamental para una mejor comprensión de la regulación de estas vías de señalización y de sus genes inducidos. También debe ayudar a facilitar el desarrollo de la DC, las vacunas contra las enfermedades infecciosas y tumores. Sin embargo, esta línea de investigación se ha visto gravemente obstaculizada por la dificultad de la transfección de primaria DC 4.
Métodos de transducción de virus, como el sistema de lentiviral, se utilizan normalmente, pero tienen muchas limitaciones, como la complejidad y la bio-peligrosos de riesgo (con los costos asociados) 5,6,7,8. Además, la entrega de los productos de los genes virales aumenta la inmunogenicidad de los países en desarrollo transducidas 9,10,11,12. La electroporación se ha utilizado con resultados mixtos 13,14,15, pero nosotros somos los primeros en reportar el uso de un protocolo de transfección de alto rendimiento y demuestran de forma concluyente su utilidad.
En este informe se resume un protocolo optimizado comerciales de alto rendimiento para la transfección de los países en desarrollo humano primario, con una toxicidad celular limitado y la falta de maduración de las DC 16. Eficiencia de transfección (del plásmido GFP) y la viabilidad celular fueron más del 50% y 70% respectivamente. FACS análisis estableció la ausencia de aumento en la expresión de la maduración de los marcadores CD86 y MHCII en las células transfectadas, mientras que QRT-PCR demostró que no había regulación al alza de IFNβ. El uso de este protocolo de electroporación, aportar pruebas para la transfección exitosa de países en desarrollo con siRNA y efectiva de derribar gen diana RIG-I, un receptor clave reconocimiento viral 16,17, tanto en el mRNA y los niveles de proteína.
Protocol
1. El programa de la lanzadera de 96 Amaxa Nucleofector
- Abra un archivo nuevo parámetro.
- Seleccione el número de pozos que va a utilizar para la transfección estándar arrastrando el cursor sobre el diagrama de placa de 96 pocillos. Use un mínimo de tres pozos a la piscina para cada muestra experimental.
- Introduzca el código del programa: en part1 seleccione 'FF' y seleccione part2 '168 'de los menús desplegables
- De 'los monocitos, humanos "Solución caja de selección
- En la Opción de control, seleccione "estándar".
- Haga clic en Aplicar.
- Para incluir un control sin transfección, seleccione los pozos más en el diagrama de como se requiere y seleccione 'No Control de programa "de la Opción de Control y haga clic en Aplicar.
- Seleccione cualquier pozos restantes no utilizados en el diagrama de la placa y haga clic en Anule.
2. Prepare los países en desarrollo para la transfección
- Todo el trabajo debe realizarse en condiciones estériles en una campana de cultivo celular que sea posible. Prepare la solución nucleofection mediante la adición de 96 y complemento de los monocitos humanos de 96 pozos de solución Nucleofector en la proporción de 450 a 2025. Mezclar y dejar a temperatura ambiente. Usted tendrá que 20μl de solución nucleofection por pozo. Crea un exceso de 10% para permitir la pipeta de error.
- Coloque el número de módulos nucleocuvette que necesita en la placa nucleocuvette en la orientación correcta, es decir la inserción de la primera de las filas 1 y 2.
- Determinar el número de centros de datos necesarios para el experimento en el cálculo de 500.000 células por pocillo y el precipitado por centrifugación a 400 g durante 10 minutos. Retire con cuidado el sobrenadante.
- Resuspender las células en la solución nucleofection pipeteando suavemente hacia arriba y abajo varias veces.
- Divida el volumen correcto de las células se resuspendieron en eppendorfs etiquetados para el tratamiento en particular por ejemplo, GLO y RIG-I.
- Añadir siRNA 0.25μg por cada 500.000 células y mezclar con la pipeta. No uso de metas de siRNA en su muestra de control no de la transfección.
- Pipeta de 20μl de la mezcla por encima a los módulos de nucleocuvette, de acuerdo a su diseño experimental, lo que garantiza que el líquido se envía al fondo del pozo.
- Cubrir la placa nucleocuvette con la tapa y llave de la placa sobre una superficie dura un par de veces para ayudar a asegurar la eliminación de burbujas de aire.
3. Transfectar los países en desarrollo
- Inserte la placa en la bandeja de transporte Nucleofector de 96 pozos, haga clic en Upload y luego comenzar.
- Seguir el progreso del proceso de transfección en la pantalla del ordenador portátil, una cruz de color negro sobre un fondo verde significa un éxito en la transfección de que así, mientras que una barra de color negro sobre un fondo rojo significa que no tuvo éxito.
- Al finalizar el proceso de transfección, retire el plato y añadir 80μl de medio de cultivo DC a cada pocillo utilizando una pipeta multicanal.
- Incubar la placa durante 10 minutos a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Transferir el volumen de 100μl de la nucleocuvettes en tubos matriz que contiene 100μl de pre-calentado medio de cultivo DC, mantener la orientación correcta.
- Retire y deseche los tubos donde la transfección no ocurrió.
- Se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 para el intervalo de tiempo de 24 horas o de otro tipo deseado.
4. Infectar a las células con NDV
- Retire los tubos de la matriz de la incubadora a la campana y los tubos de cultivo de células piscina para cada muestra experimental en eppendorfs
- Que sedimenten las células suavemente al girar en una centrífuga de sobremesa durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
- Resuspender las células en medio de cultivo libre de suero que contiene NDV en una MOI de 1 y se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 45 minutos, con eppendorfs forrados de una manera aséptica.
- Agregar 900μl de medio de cultivo DC, y volver a incubar por 80-10 h.
5. Las células de la cosecha
- Pellet células girando eppendorfs en una centrífuga de sobremesa y eliminar el sobrenadante.
- Las células de la cosecha para el ARN o la extracción de proteínas de acuerdo con el protocolo.
6. Los resultados representativos:
Utilizando el protocolo optimizado transfectadas países en desarrollo con RIGI de metas de siRNA durante 24 horas y luego se infectaron las células con NDV (un paramixovirus detectado por RIG-I) que estimulan la vía de la respuesta del interferón. De QRT-PCR análisis demostró que derribar del gen en un 75% en el nivel de transcripción. También se observó una reducción similar en la expresión de IFNβ, que es un efector corriente abajo de RIG-I en la cascada de señalización de IFN. Asimismo, se observó que la expresión de IFNβ en los no infectados, el control de las células transfectadas no fue detectable mientras que la de MxA, un gen IFNβ respuesta aguas abajo, fue mínima (Figura 1).
Una segunda transfección de países en desarrollo con RIGI de metas de siRNA se realizó con células suficiente para incluir el análisis de Western blot. Cuando elRT-PCR resultados fueron similares a lo que vimos anteriormente (62% y 66% tumbar de RIG-I y la expresión IFNβ respectivamente) (fig. 1B), el Western blot probaron para RIG-I reveló que la expresión de este gen ha sido completamente bloqueado (fig. 1C).
Figura 1. (A) MoDCs fueron transfectadas con siRNA dirigidos RIG-I o siRNA GLO no específica y el efecto sobre la expresión de RIG-I, IFNβ y MxA determinado por QRT-PCR. El protocolo de transfección utiliza un buffer de monocitos y un programa específico nucleoporation FF168 (Lonza Walkersville Inc.) Después de la incubación durante 24 h, las células transfectadas fueron infectadas, ya sea con NDV (+) o hacia la izquierda no infectados (-). Después de una incubación de 10 h, se recogieron las células y los niveles de transcripción de ARN extraído representan los resultados de dos experimentos de replicar. Tomado de Bowles et al 16. (B) MoDCs obtenida a partir de una diferente capa leucocitaria que se utiliza para la Figura 1 se transfectaron de nuevo con cualquiera de RIG-I de metas de siRNA o siRNA GLO no específica utilizando el protocolo de transfección igual que el anterior. Un control adicional con MoDCs untransfected fue incorporado en el experimento. Tras una incubación de 24 horas todas las células fueron infectadas con el NDV y se incubaron durante 10 h antes de ser cosechada, tanto para el ARN y extracción de proteínas. Los niveles de transcripción de RIG-I, IFNβ y MxA según lo determinado por QRT-PCR representan los resultados de dos experimentos de replicar. Tomado de Bowles et al 16. (C) lisados de las células se describe en la Figura 1B anteriores fueron analizados por Western blot. Calles 1 y 2, lisados de células no transfectadas, carriles 3 y 4, lisados de células transfectadas siRNA GLO, carriles 5 y 6, lisados de células transfectadas con RIG-I-targeting siRNA. Las muestras se probaron para la RIG-I y GAPDH (como control de carga) y se realizaron por duplicado. Tomado de Bowles et al 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transfección eficiente de ingenuo células dendríticas primaria es importante para el análisis de alto rendimiento e ingeniería inversa de celulares vías inflamatorias en esta celda mediador clave de la transición inmune innato-adaptación. Sin embargo, la mayoría de los investigadores encuentran que estas células son difíciles de transfectar de forma eficiente y sin la maduración procedimiento de transfección de células inducen al uso de técnicas estándar de transfección. Nosotros investigamos si estas limitaciones podrían superarse mediante la optimización de alto rendimiento utilizando el protocolo de un sistema simultáneo e independiente nuclear de 96 pozos comerciales de transfección (Lonza).
Utilizando la clasificación de células activadas fluorescentes (FACS), que mide un plásmido GFP-expresando como un marcador de la eficiencia de transfección y la inmunorreactividad CD86 y MHCII como una lectura de la maduración celular. Una serie de experimentos de evaluación de los buffers y los programas de electroporación en última instancia, identificar las condiciones que muestra la transfección> 50% y una ausencia de aumento de marcadores de maduración.
A fin de investigar la posible activación de los países en desarrollo en el proceso de nucleofection se analizaron los niveles de expresión de IFNβ y su posterior respuesta MxA gen en el ARNm. MxA expresión es exquisitamente sensible a la producción de IFNβ y puede ser utilizado como un bioensayo para detectar niveles muy bajos de la cytokine18. A través de QRT-PCR análisis se vio sin expresión IFNβ detectable, pero también vi algunos regulación al alza de MxA lo que indica que por encima de la línea base de inducción IFNβ. Sin embargo, esta regulación al alza mínima de MxA en los no infectados, el control de las células transfectadas fue muy inferior al que resulte de virus mediada por la estimulación de la cascada de señalización IFNβ (Figura 1) y confirmó que se podría utilizar con éxito el protocolo nucleoporation para transfectar los países en desarrollo sin activar a un nivel significativo.
La utilidad de nuestro protocolo optimizado fue confirmada por análisis de Western blot. La transfección de siRNA dirigidos a países en desarrollo con RIG-I causa una pérdida completa de detectar RIG-I proteínas (fig. 1C). Hay que señalar que para el éxito de la perturbación de otros genes, la cantidad de siRNA utilizado y el tiempo de transfección puede tener que ser optimizado.
Para nuestro conocimiento, este trabajo permite, por primera vez el diseño de alto rendimiento de la pérdida de la función de los estudios de primaria países en desarrollo humano, por lo tanto la solución de un obstáculo difícil de la investigación en este campo. Esto debería proporcionar nuevas oportunidades para el estudio de la DC de señalización y puede contribuir al avance en el desarrollo de inmunoterapias con sede en Washington.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El proyecto fue apoyado por el NIH NIAID Contrato HHSN2662000500021C N º. Damos las gracias a Ming Chen por su asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza Inc. | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza Inc. | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
- Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
- Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
- Aicher, Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
- Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
- Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
- Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
- Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
- Roth, Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
- Tendeloo, V. F. V. an Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
- Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
- Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
- Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
- Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
- Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).
