Summary
我々は、細胞の成熟を引き起こすことなく、プラスミドDNAやsiRNAのどちらかで初代ヒト単球由来樹状細胞をトランスフェクトの効率的な方法として私たちの最適化されたハイスループットnucleofectionのプロトコルを提示する。我々はさらなる標的遺伝子のmRNAとタンパク質レベルの両方におけるRIG - Iの成功のsiRNAサイレンシングのための証拠を提供する。
Abstract
樹状細胞（DC）は、その開始及び感染1に応答において重要な役割を果たす免疫系の歩哨と見なすことができます。ナイーブなDCによる病原性抗原の検出は、病原体関連分子パターン（PAMPS）と呼ばれる特定の保存構造を認識することができるパターン認識受容体（PRRS）によるものです。 DCによるPAMPsの検出は、成熟樹状細胞への活性化と変革をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードをトリガします。このプロセスは通常、他の炎症性サイトカインと一緒に1型インターフェロンの産生によって特徴づけられる、そのようなT細胞との相互作用が適応免疫応答2を開始する所属リンパ節への成熟DCのMHCIIとCD86および移行などの細胞表面マーカーのアップレギュレーション、 3。従って、樹状細胞は自然免疫と獲得免疫系をリンク。
様々な病原体へのDC応答の根底にある分子ネットワークを解明する能力は、これらのシグナル伝達経路の調節とその誘導性遺伝子のより良い理解に重要です。また、感染症や腫瘍に対するDCベースのワクチンの開発を容易に役立つはずです。しかし、研究のこのラインは厳しく、プライマリDCは4をトランスフェクトすることの難しさによって妨害されています。
このようなレンチウイルスシステムなどのウイルスの伝達方法は、、一般的に使用されていますが、このような複雑さやバイオ危険なリスク（関連するコストと）5,6,7,8のような多くの制限を運ぶ。また、ウイルス遺伝子産物の配信は、DC 9,10,11,12を形質導入、それらの免疫原性を増加させる。エレクトロポレーションは、混合結果13,14,15と一緒に使用、しかし、我々はハイスループットトランスフェクションのプロトコルの使用を報告し、決定的にその有用性を実証する最初のですされています。
本報告書では、限られた細胞毒性およびDCの成熟16の不在で、人間の一次樹状細胞のハイスループットトランスフェクションに最適化された商用プロトコルをまとめたものです。トランスフェクション効率（プラスミドGFPの）と細胞の生存率はそれぞれ50％以上、70％であった。定量RT - PCRは、IFNβのない上方制御を実証しないままFACS分析は、トランスフェクションされた細胞の成熟マーカーCD86とMHCIIの発現の増加の有無を設立。このエレクトロポレーションプロトコルを使用して、我々はsiRNAと標的遺伝子RIG - I、mRNAとタンパク質レベルの両方で重要なウイルス認識受容体16,17、ノックダウン効果を持つ樹状細胞の正常なトランスフェクションのための証拠を提供する。
Protocol
1。プログラムAmaxa 96ウェルシャトルNucleofector
- 新しいパラメータファイルを開きます。
- あなたが96ウェルプレートの図の上にカーソルをドラッグすることによって、標準的なトランスフェクションに使用する井戸の数を選択します。各実験サンプルのプールに3ウェルの最小値を使用してください。
- 入力プログラムコード：その1 SELECT'FF'のがpart2のselect '168"プルダウンメニューから
- ソリューションボックスを選択し"単球、人間の"から
- 制御オプションの下に"標準"を選択します。
- Applyをクリックします。
- 非トランスフェクションのコントロールを含めるには、コントロールのオプションから"いいえプログラム制御"を選択しないと適用をクリックし、必要に応じてダイアグラムからさらに井戸を選択し、。
- プレートダイアグラム上の任意の残りの未使用のウェルを選択して、定義解除をクリックしてください。
2。トランスフェクションのためにDCを準備
- すべての作業が可能であれば、細胞培養フードに無菌条件下で行う必要があります。 450から2025までの比でヒト単球を96ウェルNucleofectorソリューションへの補足96ウェル添加することによりnucleofectionの溶液を調製します。混和後、室温まで昇温することができます。あなたは、ウェルあたりnucleofectionソリューションの20μlのが必要になります。エラーをピペッティングを可能にするために10％以上を行う。
- 行1および2に最初のものを挿入すること、すなわち、正しい向きでnucleocuvetteプレートに必要なnucleocuvetteモジュールの数を置きます。
- あなたの実験は10分間400グラムで遠心分離することによっても、ペレットに50万セルに計算に必要なDCの数を決定します。注意深く上清を取り除く。
- 軽く数回上下にピペッティングしてnucleofectionの溶液中で細胞を再懸濁します。
- 特定の治療などGLOとRIG - I用のラベルeppendorfsに再懸濁した細胞の正しい量を割ります。
- ピペッティングで500,000個の細胞と混合あたり0.25μgのsiRNAを追加。あなたの非トランスフェクションのコントロールサンプルにおける非標的とするsiRNAを使用してください。
- nucleocuvetteモジュールに上記混合物のピペット20μlのは、あなたの実験的なレイアウトに応じて、液体を確保することは井戸の底に配信されます。
- 気泡の除去を確保するために数回蓋付きnucleocuvetteプレートをカバーし、ハード面にプレートをタップします。
3。トランスフェクションのDC
- Nucleofector 96ウェルシャトルのトレーにプレートを挿入し、アップロードをクリックしてから開始します。
- ラップトップのディスプレイ上にトランスフェクションのプロセスの進行に従ってください。赤い背景に黒いバーがそれが失敗したという意味のに対し、緑の背景に黒の十字架は、そのほかに成功したトランスフェクションを示します。
- トランスフェクションのプロセスの完了時に、プレートを取り外し、よくマルチチャンネルピペットを使用してそれぞれにDCの増殖培地の80μlを加える。
- 37℃および5％CO 2を 10分間インキュベートする。
- 正しい方向を維持し、予め温めておいたDCの増殖培地100μlのを含む行列のチューブにnucleocuvettesから100μlのボリュームを転送する。
- トランスフェクションが発生していないそれらのチューブを取り外して廃棄。
- 37 ° C、5％の24時間またはその他の所望の時間間隔のためのCO 2。
4。 NDVで細胞を感染させる
- eppendorfsに各実験サンプルのためにインキュベーターから細胞培養フードとプールのチューブに行列のチューブを取り外します
- ペレット5分間卓上遠心機でスピンし、上清を除去することにより穏やかに細胞。
- MOI 1でNDVを含む無血清増殖培地中で細胞を再懸濁し、37℃と緩く無菌的に覆われてeppendorfs 5％45分間CO 2、。
- 80〜10時間還流DCの増殖培地の900μl、および再インキュベートする
5。細胞を回収
- 卓上遠心機でeppendorfsを回転し、上清を除去することにより細胞をペレット化する。
- あなたのプロトコルに従ってRNAやタンパク質の抽出のための細胞を回収。
6。代表的な結果：
私たちの最適化されたプロトコルを用いて、我々は、NDV（RIG - Iによって検出されたパラミクソウイルス）を持つ細胞はインターフェロン応答の経路を刺激するために感染して24時間とするためのリギ -標的とするsiRNAと樹状細胞をトランスフェクション。定量RT - PCR解析により、我々は、転写レベルで75％の遺伝子のノックダウンを示した。我々はまた、RIG - I IFNシグナル伝達カスケードの下流エフェクターであるIFNβの発現で同様の減少を、観察。さらに、MXA、IFNβ下流応答遺伝子、のそれは（図1A）最小限のだった一方、非感染、コントロール、トランスフェクトされた細胞におけるIFNβの発現は検出できなかったことを観察した。
と樹状細胞の第二のトランスフェクションリギ -標的とするsiRNAすることはウエスタンブロット解析を含むのに十分な細胞を用いて行った。ここで、RT - PCRの結果が（図1B）（62％、66％がノックダウンRIG - IとIFNβの発現をそれぞれ）我々が以前に見たものと似ていた、ウエスタンブロットはをプローブRIG - Iは、この遺伝子の発現があったことを明らかに完全に（図1C）がブロック。
図1。 （A）MoDCsはRIG - Iまたは非特異的GLOのsiRNAと定量RT - PCRによって決定されるRIG - I、IFNβ及びMXAの発現に影響を標的どちらのsiRNAでトランスフェクションした。 （ - ）トランスフェクションプロトコルは、単球特有のバッファとnucleoporationプログラムFF168（ロンザウォーカー社）で24時間インキュベーションを使用する、トランスフェクションされた細胞は、いずれのNDV（+）または左に感染していないに感染させた。 10時間さらにインキュベーション後、細胞を回収し、RNA抽出された転写産物のレベルは、2つのレプリカの実験の結果を表していた。ボウルズら 16から撮影。（B）図1Aに使用されるように別のバフィーコートから得られたMoDCsが再度上記と同じトランスフェクションのプロトコルを使用して、いずれかのRIG - I -標的とするsiRNAまたは非特異的GLO siRNAでトランスフェクトした。トランスフェクトされていないMoDCsを使用して、追加のコントロールが実験に組み込まれた。 24時間のインキュベーションに続いてすべてのセルは、NDVを感染させ、RNAとタンパク質抽出の両方のために伐採される前に、さらに10時間インキュベートした。 RIG - I、IFNβ及び定量RT - PCRによって決定されるMXAの転写レベルは、2つのレプリカの実験の結果を表します。ボウルズら 16から撮影。（C）上記の図1Bに記載の細胞からのライセートをウェスタンブロットにより分析した。レーン1および2は、トランスフェクトされていない細胞からのライセート、レーン3および4は、GLOのsiRNAをトランスフェクションされた細胞からのライセート、レーン5および6は、RIG - I -標的とするsiRNAでトランスフェクトされた細胞からのライセート。サンプルは、RIG - IともGAPDH（ローディングコントロールとして）との重複で実行されたためにプローブした。ボウルズら 16から撮影。
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Discussion
ナイーブな一次樹状細胞の効率的なトランスフェクションは、ハイスループット解析および自然免疫、獲得免疫の移行を仲介するこの重要な細胞内の細胞の炎症性経路のリバースエンジニアリングのために重要です。しかし、ほとんどの研究者はこれらの細胞は標準的なトランスフェクション技術を使用している場合の両方を効率的かつトランスフェクションの手順を誘導する細胞の成熟せずにトランスフェクトすることが困難であることがわかる。我々はこれらの制限は、同時、独立した96ウェルの商業用原子力トランスフェクションシステム（ロンザ）を使用して、高スループットのプロトコルの最適化によって克服されるかどうかを調べた。
蛍光活性化細胞選別（FACS）を使用して、我々はGFP発現細胞の成熟の読み出しなどのトランスフェクション効率とCD86とMHCII免疫反応性のマーカーとしてプラスミドを測定した。バッファとエレクトロポレーションプログラムを評価する一連の実験は、最終的には> 50％のトランスフェクション及び成熟マーカーの増加の有無を示す条件を同定した。
さらに我々はIFNβおよびmRNAレベルでその下流応答遺伝子のMXAの発現レベルを分析したnucleofectionプロセスによるDCの可能な活性化を調査する。MXA式はにIFNβ生産に非常に敏感であり、非常に低いレベルのを検出するバイオアッセイとして使用することができますcytokine18。定量RT - PCR解析を通して、私たちは、検出可能IFNβの発現を見たことがMXAは、このように、上記ベースラインIFNβの誘導を示すいくつかのアップレギュレーションを参照してくださいでした。しかし非感染、コントロール、トランスフェクトされた細胞のMXAのこの最小限のアップレギュレーションは、そのIFNβシグナル伝達カスケード（図1A）のウイルス媒介刺激に起因すると比較するとごくわずかであったと我々は正常にアクティブにすることなくDCをトランスフェクトするために私たちのnucleoporationのプロトコルを使用することができることを確認それらの重要なレベルに。
私たちの最適化されたプロトコルのユーティリティは、ウェスタンブロット分析によって確認した。標的とするsiRNAと樹状細胞のトランスフェクションRIGは、- Iは、検出可能なRIG - Iタンパク質（図1C）の完全な損失を引き起こした。我々は、他の遺伝子の正常な摂動のために、使用されたsiRNAとトランスフェクション時間の長さの量を最適化する必要があることに注意してください。
我々の知る限り、この作業は、このように、この分野の研究に困難な障害を解決する、初めての一次ヒトDCにおける高スループットの機能喪失研究の設計が可能になります。これにより、DC信号の研究に新たな機会を提供する必要がありますし、DCベースの免疫療法の開発の進展に貢献するかもしれない。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
プロジェクトはNIH NIAID契約番号HHSN2662000500021Cによってサポートされていました。我々は彼の技術支援のために明陳に感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza Inc. | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza Inc. | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
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