Summary
Vi presentiamo il nostro sito ottimizzato high-throughput protocollo nucleofection come un modo efficace di trasfezione delle cellule dendritiche umane primarie derivate da monociti sia con DNA plasmidico o siRNA senza provocare la maturazione delle cellule. Abbiamo inoltre fornire le prove per il silenziamento del gene siRNA successo mirati RIG-I, sia a livelli di mRNA e proteine.
Abstract
Le cellule dendritiche (DC) può essere considerato sentinelle del sistema immunitario che svolgono un ruolo critico nella sua iniziazione e la risposta alle infezioni 1. Rilevazione dell'antigene patogeni da DC ingenuo è attraverso i recettori pattern recognition (PRR) che sono in grado di riconoscere specifiche strutture conservate denominate modelli molecolari patogeni associati (PAMPs). Rilevazione di PAMPs da DC innesca una cascata di segnalazione intracellulare con conseguente loro attivazione e la trasformazione di DC mature. Questo processo è tipicamente caratterizzata da produzione di interferone di tipo 1 insieme ad altre citochine proinfiammatorie, sovraregolazione di marcatori cellulari di superficie come MHCII e CD86 e la migrazione delle DC mature ai linfonodi drenanti, dove l'interazione con le cellule T avvia la risposta immunitaria adattativa 2, 3. Così, DC collegare i sistemi immunitario innato e adattativo.
La capacità di sezionare le reti molecolari alla base della risposta DC a vari agenti patogeni è fondamentale per una migliore comprensione del regolamento di queste vie di segnalazione e le loro geni indotti. Dovrebbe anche contribuire a facilitare lo sviluppo di DC-based vaccini contro le malattie infettive e tumori. Tuttavia, questa linea di ricerca è stato gravemente ostacolato dalla difficoltà di trasfezione primario DC 4.
Metodi di trasduzione del virus, come il sistema lentivirale, sono tipicamente utilizzati, ma portano molti limiti come la complessità e bio-pericolosi rischio (con i costi associati) 5,6,7,8. Inoltre, la consegna dei prodotti gene virale aumenta l'immunogenicità di coloro trasdotte DC 9,10,11,12. Elettroporazione è stata utilizzata con risultati alterni 13,14,15, ma siamo i primi a segnalare l'utilizzo di un high-throughput protocollo di trasfezione e definitivamente dimostrare la sua utilità.
In questa relazione si riassumono un protocollo ottimizzato commerciale high-throughput per la transfezione di DC umane primarie, con limitata tossicità delle cellule e l'assenza di maturazione DC 16. L'efficienza di trasfezione (di plasmide GFP) e la vitalità delle cellule erano più del 50% e 70% rispettivamente. FACS analisi stabilito l'assenza di aumento di espressione della maturazione e MHCII marker CD86 in cellule trasfettate, mentre qRT-PCR ha dimostrato di non sovraregolazione IFNβ. Usando questo protocollo di elettroporazione, forniamo le prove per la trasfezione di successo di DC con siRNA ed efficace di abbattere genica mirata RIG-I, un recettore chiave riconoscimento virale 16,17, sia a livelli di mRNA e proteine.
Protocol
1. Programmare il Amaxa 96 pozzetti navetta Nucleofector
- Aprire un nuovo file di parametri.
- Selezionare il numero di pozzi che verrà utilizzato per la trasfezione di serie trascinando il cursore sul diagramma 96 pozzetti. Usare un minimo di 3 pozzi di piscina per ogni campione sperimentale.
- Inserire il codice del programma: in part1 selezionare 'FF' e in part2 selezionare '168 'dal menu a discesa
- Dalla soluzione casella di selezione 'Monocita, umano'
- Secondo l'opzione di controllo, selezionare 'standard'.
- Fare clic su Applica.
- Per includere una no-transfezione di controllo, selezionare ulteriori pozzi dal diagramma come richiesto e poi scegliere 'No Control Program' Opzione di controllo e fare clic su Applica.
- Selezionare qualsiasi pozzi rimasti inutilizzati sul diagramma piatto e cliccare su undefine.
2. Preparare DC per la trasfezione
- Tutto il lavoro dovrebbe essere fatto in condizioni di sterilità in una cappa di coltura cellulare, se possibile. Preparare la soluzione nucleofection con l'aggiunta di ben 96-supplemento al monociti umani a 96 pozzetti Soluzione Nucleofector nel rapporto di 450 al 2025. Mescolare e lasciare a temperatura ambiente. Avrete bisogno di 20μl di soluzione nucleofection per bene. Fai un eccesso del 10% per consentire pipettaggio errore.
- Collocare il numero di moduli nucleocuvette è necessario nella piastra nucleocuvette nel corretto orientamento cioè inserendo la prima in a righe 1 e 2.
- Determinare il numero di controller necessari per l'esperimento calcolo su 500.000 cellule per bene e pellet per centrifugazione a 400g per 10 minuti. Rimuovere con attenzione il sopranatante.
- Risospendere le cellule nella soluzione nucleofection pipettando gentilmente su e giù un paio di volte.
- Dividere la giusta quantità di cellule risospese in eppendorfs l'etichetta per il particolare trattamento ad esempio GLO e RIG-I.
- Aggiungi siRNA 0.25μg per 500.000 cellule e mescolare pipettando. Uso non-targeting siRNA nel no-trasfezione campione di controllo.
- Pipettare 20μl delle miscele sopra nel nucleocuvette moduli, in base al layout sperimentale, assicurando il liquido viene consegnato al fondo del pozzo.
- Coprire la piastra nucleocuvette con il coperchio e toccare la piastra su una superficie dura un paio di volte per contribuire a garantire la rimozione di bolle d'aria.
3. Trasfezione DC
- Inserire la piastra nel cassetto Nucleofector navetta a 96 pozzetti, clicca su Carica e quindi avviare.
- Seguire i progressi del processo di trasfezione sul display del computer portatile, una croce nera su sfondo verde significa una trasfezione di successo in quel pozzo, mentre una barra nera su sfondo rosso, significa che non ha avuto successo.
- Al termine del processo di trasfezione, rimuovere la piastra e aggiungere 80μl di terreno di crescita continua in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale.
- Incubare piastra per 10 minuti a 37 ° C e 5% di CO 2.
- Trasferire il volume di 100μl dal nucleocuvettes in provette contenenti 100μl di matrice pre-riscaldato medio DC crescita, mantenendo l'orientamento corretto.
- Rimuovere e scartare quei tubi in cui la transfezione non si è verificato.
- Incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per 24 ore o altri intervallo di tempo desiderato.
4. Infettare le cellule con NDV
- Rimuovere i tubi matrice dal termostato alla cappa di coltura cellulare e tubi in piscina per ogni campione sperimentale in eppendorfs
- Agglomerare le cellule dolcemente facendo girare in una centrifuga da tavolo per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
- Risospendere le cellule nel siero senza mezzo di crescita contenente NDV ad una MOI di 1 e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per 45 min, con eppendorfs vagamente coperto in maniera sterile.
- Aggiungere 900μl di mezzo di crescita continua, e ri-incubare per 8-10 h.
5. Raccogliere cellule
- Celle a pellet dal giro eppendorfs in una centrifuga da tavolo e rimuovere il surnatante.
- Celle di raccolta per l'RNA o l'estrazione di proteine secondo il protocollo.
6. Rappresentante dei risultati:
Usando il nostro protocollo ottimizzato abbiamo DC transfettate con RIGI-targeting siRNA per 24 ore e poi le cellule infettate con NDV (un paramyxovirus rilevato da RIG-I) per stimolare il percorso di risposta all'interferone. Da qRT-PCR abbiamo dimostrato abbattere del gene del 75% a livello di trascrizione. Abbiamo anche osservato una riduzione simile nell'espressione di IFNβ, che è un effettore a valle di RIG-I nella cascata IFN segnalazione. Inoltre, abbiamo osservato che l'espressione di IFNβ a non infette, controllo transfettate cellule non era rilevabile mentre quello di MxA, un gene IFNβ risposta a valle, è stato minimo (figura 1A).
Una seconda trasfezione DC con RIGI-targeting siRNA è stata effettuata utilizzando cellule sufficiente per comprendere l'analisi Western Blot. Qualora ilRT-PCR risultati sono stati simili a quanto visto in precedenza (62% e il 66% di abbattere RIG-I ed espressione IFNβ rispettivamente) (Figura 1B), il Western Blot sondato per RIG-I ha rivelato che l'espressione di questo gene era stato completamente bloccato (Figura 1C).
Figura 1. (A) MoDCs sono state trasfettate con siRNA o targeting RIG-I o siRNA GLO aspecifici e l'effetto sulla espressione di RIG-I, IFNβ e MxA determinato dalla qRT-PCR. Il protocollo di trasfezione usato un monociti-specifico buffer e programma nucleoporation FF168 (Lonza Walkersville Inc.) Dopo incubazione per 24 ore, le cellule transfettate erano o infettati con NDV (+) o sinistra non infetti (-). Dopo un ulteriore incubazione per 10 ore, le cellule sono state raccolte e dei livelli di trascrizione RNA estratto rappresentano i risultati di due esperimenti di replicare. Tratto da Bowles et al 16. (B) MoDCs ottenuti da una mano diversa buffy come usato per la figura 1A sono stati nuovamente trasfettate sia con RIG-I-targeting siRNA o siRNA GLO aspecifico utilizzando lo stesso protocollo di trasfezione come sopra. Un ulteriore controllo utilizzando MoDCs untransfected è stato incorporato l'esperimento. A seguito di una 24 ore di incubazione tutte le cellule sono state infettate con NDV e incubate per 10 h prima di essere raccolte sia per estrazione di RNA e proteine. I livelli di trascrizione di RIG-I, IFNβ e MxA come determinato dal qRT-PCR rappresentano i risultati di due esperimenti di replicare. Tratto da Bowles et al 16. (C) lisati da cellule descritto nella Figura 1B sopra sono stati analizzati mediante Western Blot. Corsie 1 e 2, lisati da cellule untransfected; corsie 3 e 4, lisati da cellule transfettate siRNA GLO, corsie 5 e 6, lisati da cellule transfettate con RIG-I-targeting siRNA. I campioni sono stati sondati per RIG-I e anche GAPDH (come controllo di carico) e sono stati eseguiti in duplicato. Tratto da Bowles et al 16.
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Discussion
Trasfezione efficiente ingenuo cellule dendritiche primario è importante per l'analisi di un elevato throughput e reverse engineering di cellulari vie infiammatorie in questa cellula fondamentale della mediazione innata-adaptive transizione del sistema immunitario. Tuttavia, la maggior investigatori scoprire che queste cellule sono di difficile trasfezione in modo efficiente e senza la maturazione di transfezione delle cellule procedura di induzione quando si utilizzano tecniche di trasfezione standard. Abbiamo studiato se questi limiti potrebbero essere superati attraverso l'ottimizzazione del protocollo ad alta velocità utilizzando una simultanea, sistema indipendente a 96 pozzetti commerciale trasfezione nucleare (Lonza).
Utilizzando fluorescenti separazione delle cellule attivate (FACS), abbiamo misurato un GFP che esprimono plasmide come marker di efficienza di trasfezione e immunoreattività CD86 e MHCII come una lettura di maturazione delle cellule. Una serie di esperimenti valutazione buffer e programmi di elettroporazione in ultima analisi, identificare le condizioni che mostra trasfezione> 50% e l'assenza di aumento dei marker di maturazione.
Per approfondire ulteriormente possibile attivazione delle DC dal processo nucleofection abbiamo analizzato i livelli di espressione di IFNβ e la sua valle MxA gene risposta a livello di mRNA. MxA espressione è estremamente sensibile alla produzione IFNβ e può essere usato come un test biologico per rilevare livelli molto bassi di il cytokine18. Attraverso qRT-PCR abbiamo visto nessuna espressione rilevabile IFNβ ma ho visto alcune sovraregolazione di MxA indicando così sopra-basale induzione IFNβ. Tuttavia questo upregulation minimo di MxA a non infette, controllo transfettate cellule è stata trascurabile rispetto a quello risultante dal virus-mediata stimolazione della cascata IFNβ segnalazione (Figura 1A) e ha confermato che si possa usare con successo il nostro protocollo nucleoporation per trasfettare DC senza attivare a qualsiasi livello significativo.
L'utilità del nostro protocollo ottimizzato è stato confermato da analisi Western blot. Trasfezione di siRNA DC con targeting RIG-I ha provocato una perdita completa della rilevabili proteina RIG-I (Figura 1C). Dobbiamo notare che per la perturbazione di successo di altri geni, la quantità di siRNA usati e la lunghezza del tempo trasfezione può essere ottimizzato.
A nostra conoscenza, questo lavoro permette per la prima volta la progettazione di high-throughput perdita di funzione studi primari DCs umane, risolvendo così un ostacolo difficile da ricerca in questo campo. Ciò dovrebbe fornire nuove opportunità per lo studio della DC di segnalazione e possono contribuire al progresso nello sviluppo di DC-based immunoterapie.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il progetto è stato sostenuto da NIH Contratto NIAID No. HHSN2662000500021C. Ringraziamo Ming Chen per la sua assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza Inc. | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza Inc. | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
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