Summary
نحن حاضرنا الأمثل بروتوكول nucleofection عالية الإنتاجية باعتبارها وسيلة فعالة لtransfecting الوحيدات الإنسان الأساسية المستمدة من الخلايا الجذعية إما مع DNA البلازميد أو سيرنا دون التسبب في نضوج الخلايا. ونحن نقدم أدلة أخرى لإسكات سيرنا الناجح لاستهداف الجينات RIG - I مرنا في كل المستويات والبروتين.
Abstract
ويمكن اعتبار الخلايا الجذعية (DCS) حراسا للنظام المناعي والتي تلعب دورا حاسما في بدء وردا على العدوى 1. الكشف عن مستضد الممرضة التي السذاجة البلدان النامية من خلال التعرف على الأنماط مستقبلات (PRRs) والتي هي قادرة على الاعتراف هياكل محددة الحفظ ويشار إلى الممرض المرتبطة بأنماط الجزيئي (PAMPS). كشف من قبل البلدان النامية PAMPs مشغلات تسقط إشارات بين الخلايا مما يؤدي إلى تنشيط والتحول إلى البلدان النامية ناضجة. وتتميز عادة هذه العملية من خلال انتاج الانترفيرون من النوع 1 جنبا إلى جنب مع السيتوكينات proinflammatory أخرى ، upregulation من علامات سطح الخلية مثل MHCII وCD86 والهجرة في العاصمة ناضجة لتصريف الغدد الليمفاوية ، حيث التفاعل مع الخلايا التائية يبدأ الاستجابة المناعية التكيفية 2 ، 3. وبالتالي ، DCS ربط أنظمة المناعة الفطرية والتكيفية.
القدرة على تشريح الشبكات الجزيئية الكامنة وراء العاصمة ردا على مسببات الأمراض المختلفة ضروري لفهم أفضل لتنظيم هذه المسارات إشارة وجيناتها المستحث. وينبغي أن يساعد أيضا تسهيل تطوير العاصمة مقرا لقاحات ضد الأمراض المعدية والأورام. ومع ذلك ، فقد كان هذا الخط من البحوث أعاق بشدة من جراء صعوبة transfecting البلدان النامية الأولية 4.
وعادة ما تستخدم أساليب تنبيغ الفيروس ، مثل نظام lentiviral ، ولكنها تحمل الكثير من القيود مثل التعقيد والمخاطر البيولوجية الخطرة (مع التكاليف المرتبطة بها) 5،6،7،8. بالإضافة إلى ذلك ، وتسليم المنتجات الجين الفيروسي يزيد من استمناع تلك transduced 9،10،11،12 البلدان النامية. وقد استخدمت Electroporation مع نتائج مختلطة 13،14،15 ، ولكن نحن أول من التقرير استخدام بروتوكول ترنسفكأيشن الإنتاجية العالية ، وتثبت بشكل قاطع فائدتها.
نحن في هذا التقرير تلخيص وضع بروتوكول تجاري لتحسين الإنتاجية العالية من البلدان النامية ترنسفكأيشن الأولية الإنسان ، مع سمية الخلية محدودة وعدم وجود نضوج العاصمة 16. وكانت الكفاءة ترنسفكأيشن (من البلازميد GFP) وبقاء الخلية أكثر من 50 ٪ و 70 ٪ على التوالي. أنشئت FACS تحليل غياب زيادة في التعبير عن علامات النضج وCD86 MHCII transfected في الخلايا ، في حين تظاهر qRT - PCR لا upregulation من IFNβ. باستخدام هذا البروتوكول electroporation ، ونحن نقدم الدليل على نجاح ترنسفكأيشن البلدان النامية مع سيرنا وفعالة نهدم من الجينات المستهدفة RIG - I ، مفتاح مستقبلات الاعتراف الفيروسي 16،17 في مرنا على حد سواء ، ومستويات البروتين.
Protocol
1. برنامج ال 96 Amaxa Nucleofector المكوك جيدا
- فتح ملف المعلمة الجديدة.
- تحديد عدد الآبار التي ستستخدم لترنسفكأيشن القياسية عن طريق سحب المؤشر على الرسم البياني 96 لوحة جيدا. استخدام الحد الأدنى من 3 آبار لتجميع لكل عينة تجريبية.
- إدخال رمز البرنامج : في PART1 "FF" في اختيار وتحديد part2 '168' من القوائم المنسدلة
- حدد مربع من الحل "، الوحيدات البشرية"
- حدد الخيار تحت مراقبة 'معيار'.
- انقر على تطبيق.
- لتشمل مراقبة عدم ترنسفكأيشن ، حدد مزيد من الآبار المخطط كما هو مطلوب ثم اختر 'لا يوجد برنامج التحكم" من خيار التحكم وانقر على تطبيق.
- حدد أي الآبار المتبقية غير المستخدمة على لوحة الرسم وانقر على Undefine.
2. إعداد البلدان النامية لترنسفكأيشن
- وينبغي أن يتم كل العمل تحت ظروف معقمة في خلية غطاء الثقافة حيثما أمكن ذلك. إعداد الحل nucleofection بإضافة 96 - جيدا لتكملة الإنسان الوحيدات 96 Nucleofector الحل جيدا في نسبة من 450 إلى عام 2025. مزيج دافئ والسماح لدرجة حرارة الغرفة. ستحتاج 20μl حل nucleofection لكل بئر. جعل وجود فائض قدره 10 ٪ للسماح pipetting الخطأ.
- وضع عدد من الوحدات nucleocuvette تحتاج إلى لوحة nucleocuvette في الاتجاه الصحيح أي إدراج أول واحد في الصفوف 1 و 2.
- تحديد عدد من البلدان النامية بحاجة لتجربتك على حساب الخلايا لكل 500،000 جيدا وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 400g عن 10min. إزالة بعناية طاف.
- Resuspend الخلايا في حل nucleofection بواسطة pipetting بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات.
- تقسيم وحدة التخزين الصحيحة من الخلايا معلق في eppendorfs المسمى لGLO العلاج خاصة وعلى سبيل المثال RIG - I.
- إضافة سيرنا 0.25μg لكل 500،000 الخلايا ومزيج من قبل pipetting. عدم استخدام استهداف سيرنا في عينتك عدم السيطرة ترنسفكأيشن.
- ماصة 20μl من الخلائط أعلاه إلى وحدات nucleocuvette ، وفقا لتخطيط لتجريبية ، وضمان سائلة يتم تسليمها إلى أسفل البئر.
- تغطية لوحة nucleocuvette مع غطاء والاستفادة من لوحة على سطح صلب عدة مرات للمساعدة على ضمان إزالة فقاعات الهواء.
3. Transfect البلدان النامية
- إدراج لوحة في درج Nucleofector المكوك 96 - جيدا ، وانقر على تحميل ثم بدء.
- متابعة التقدم المحرز في عملية ترنسفكأيشن في اللفة عرض أعلى ؛ عرضية سوداء على خلفية خضراء ترنسفكأيشن يدل على نجاحها في ذلك جيدا ، في حين ان شريط أسود على خلفية حمراء يعني أنها كانت ناجحة.
- عند الانتهاء من عملية ترنسفكأيشن ، وإزالة لوحة وإضافة 80μl متوسطة النمو المستمر إلى كل جيدا باستخدام ماصة الأقنية.
- احتضان لوحة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- حجم نقل 100μl من nucleocuvettes في أنابيب تحتوي على مصفوفة 100μl من قبل تحسنت العاصمة المتوسطة النمو ، والحفاظ على الاتجاه الصحيح.
- إزالة والتخلص من تلك الأنابيب ترنسفكأيشن حيث لم يحدث.
- احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 لل24H أو غيرها من الفاصل الزمني المطلوب.
4. تصيب الخلايا مع NDV
- إزالة أنابيب مصفوفة من الحاضنة إلى الخلية هود الثقافة وأنابيب تجمع لكل عينة تجريبية في eppendorfs
- بيليه الخلايا برفق من خلال الدوران في مكتب لجهاز الطرد المركزي الأعلى لمدة 5 دقائق وإزالة طاف.
- Resuspend الخلايا في النمو المتوسطة المصل خالية NDV تحتوي على وزارة الداخلية في جامعة النجاح واحتضان من 1 إلى 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 لمدة 45 دقيقة ، مع تغطية eppendorfs فضفاضة بطريقة عقيمة.
- إضافة 900μl متوسطة النمو العاصمة ، وإعادة احتضان مقابل 80-10 ساعة.
5. حصاد الخلايا
- بيليه الخلايا من خلال الدوران eppendorfs في مكتب أعلى الطرد المركزي وإزالة طاف.
- خلايا الحمض النووي الريبي لالحصاد أو استخراج البروتين وفقا للبروتوكول الخاص.
6. ممثل النتائج :
باستخدام بروتوكول لدينا الأمثل transfected نحن البلدان النامية مع ريجي استهداف سيرنا لمدة 24 ساعة وبعد ذلك الخلايا المصابة مع NDV (أ الفيروسة المخاطانية الكشف عنها بواسطة I - RIG) لتنشيط المسار استجابة انترفيرون. بواسطة qRT - PCR تحليل أثبتنا نهدم من الجين بنسبة 75 ٪ على مستوى النسخ. لاحظنا أيضا انخفاض مماثل في التعبير عن IFNβ ، وهو المستجيب المصب I - تلاعب في تتالي إشارات الإنترفيرون. علاوة على ذلك ، لاحظنا أن التعبير عن IFNβ في الخلايا غير المصابة التحكم transfected ، كان لا يمكن كشفها في حين أن MxA ، وهو الجين IFNβ استجابة المصب ، وكان الحد الأدنى (الشكل 1A).
A ترنسفكأيشن الثانية من البلدان النامية مع ريجي استهداف سيرنا أجريت باستخدام الخلايا بما يكفي لتشمل تحليل لطخة غربية. حيثوRT - PCR نتائج مماثلة لما شهدناه في السابق (62 ٪ و 66 ٪ من نهدم RIG - I على التوالي والتعبير IFNβ) (الشكل 1B) ، للبحث عن لطخة غربية RIG - I كشفت أن التعبير عن هذا الجين قد تم سدت تماما (الشكل 1C).
الشكل 1. (A) وtransfected MoDCs إما مع سيرنا استهداف RIG - I أو غير محدد سيرنا GLO والتأثير على التعبير عن RIG - I IFNβ وMxA يحددها qRT - PCR. وكان البروتوكول ترنسفكأيشن استخدام العازلة الوحيدات محددة وبرنامج nucleoporation FF168 (Lonza Walkersville شركة) الحضانة وبعد لمدة 24 ساعة ، اما الخلايا المصابة transfected مع NDV (+) أو غير مصاب اليسار (--). بعد مزيد من الحضانة لمدة 10 ساعة ، وكان حصاد الخلايا والحمض النووي الريبي مستويات استخراج نسخة تمثل نتائج تجربتين تكرار. مأخوذة من بولز وآخرون 16 (B) ومرة أخرى transfected MoDCs الحصول عليها من معطف الشهباء مختلفة كما تستخدم في الشكل 1A إما مع RIG - I - استهداف سيرنا أو غير محدد سيرنا GLO باستخدام بروتوكول ترنسفكأيشن نفس أعلاه. وقد أدرج عنصر تحكم إضافية باستخدام MoDCs untransfected في التجربة. بعد 24 ساعة حضانة أصيبوا كافة الخلايا مع NDV والمحتضنة لمزيد من 10 ساعة قبل أن يتم حصاد كل من الحمض النووي الريبي واستخراج البروتين. مستويات نص RIG - I IFNβ ، وعلى النحو الذي يحدده MxA qRT - PCR تمثل نتائج تجربتين تكرار. مأخوذة من بولز 16 آخرون (C) وحللت Lysates من خلايا وصفها في الشكل 1B أعلاه لطخة غربية. حارات 1 و 2 ، lysates من خلايا untransfected ؛ الممرات 3 و 4 من خلايا lysates سيرنا GLO transfected ؛ الممرات 5 و 6 من خلايا lysates transfected مع RIG - I استهداف سيرنا. وكانت عينات للبحث I - RIG وكذلك GAPDH (كعنصر تحكم التحميل) وكانت تعمل في مكررة. مأخوذة من بولز 16 آخرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية الأولية السذاجة المهم لتحليل إنتاجية عالية والهندسة العكسية من التهابات المسالك الخليوي في هذه الخلية الرئيسية تتوسط الانتقال فطرية - التكيف المناعي. ومع ذلك ، فإن معظم المحققين وجدت أن هذه الخلايا من الصعب على حد سواء transfect بكفاءة ودون نضوج الخلية الداخلي ترنسفكأيشن حمل عند استخدام تقنيات ترنسفكأيشن القياسية. نحن التحقيق ما إذا كان يمكن التغلب على هذه القيود التي مرت عالية باستخدام بروتوكول التحسين ومستقل في وقت واحد 96 - جيدا النظام التجاري ترنسفكأيشن النووي (Lonza).
فلوري الفرز باستخدام خلية تنشيطه (FACS) ، ويقاس لدينا GFP - معربا عن البلازميد كمؤشر لكفاءة وتفاعلية مناعية ترنسفكأيشن CD86 وMHCII بوصفها قراءات من نضوج الخلايا. سلسلة من التجارب والبرامج مخازن تقييم electroporation حددت في نهاية المطاف الشروط تبين> ترنسفكأيشن 50 ٪ وعدم وجود زيادة في علامات النضج.
لمزيد من التحقيق التنشيط ممكن من البلدان النامية من خلال عملية nucleofection قمنا بتحليل مستويات التعبير الجيني في IFNβ وردا MxA المتلقين على المستوى مرنا. MxA التعبير هي حساسة بشكل رائع لإنتاج IFNβ ويمكن استخدامها بوصفها الأحيائي للكشف عن مستويات منخفضة جدا من وcytokine18. من خلال تحليل PCR - qRT رأينا لا يمكن كشفها IFNβ التعبير ولكنها لم تشاهد بعض upregulation من MxA مما يدل على الأساس المذكور تحريض IFNβ. ولكن هذا الحد الأدنى من upregulation MxA في الخلايا غير المصابة التحكم transfected ، لا تذكر بالمقارنة مع تلك الناتجة من تحفيز الفيروسات بوساطة من تتالي IFNβ الإشارات (الشكل 1A) ، وأكد أننا يمكن أن تستخدم بنجاح لدينا بروتوكول nucleoporation إلى البلدان النامية دون تفعيل transfect إلى أي مستوى كبير.
وأكد فائدة بروتوكول لدينا الأمثل من خلال تحليل لطخة غربية. ترنسفكأيشن من البلدان النامية مع سيرنا استهداف RIG - I تسبب في خسارة كاملة للبروتين RIG - I كشفها (الشكل 1C). وينبغي أن نلاحظ أن لاضطراب ناجحة من الجينات الأخرى ، ومبلغ سيرنا المستخدمة وطول الوقت ترنسفكأيشن قد تضطر إلى أن يكون الأمثل.
على حد علمنا ، وهذا العمل يسمح للمرة الاولى في تصميم الدراسات الخسارة من وظيفة عالية الإنتاجية في البلدان النامية الإنسان الأساسية ، وبالتالي حل عقبة صعبة للبحوث في هذا المجال. هذا يجب أن توفر فرصا جديدة لدراسة إشارة العاصمة ويمكن أن تسهم في التقدم في تطوير العاصمة مقرا المناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة العقد رقم HHSN2662000500021C المعدية. نشكر تشن مينغ لمساعدته التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza Inc. | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza Inc. | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
- Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
- Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
- Aicher, Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
- Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
- Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
- Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
- Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
- Roth, Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
- Tendeloo, V. F. V. an Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
- Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
- Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
- Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
- Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
- Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).
