Summary
Biz plazmid DNA hücresinin olgunlaşması neden olmaksızın veya siRNA birincil insan monosit türevli dendritik hücreler transfecting etkin bir yolu olarak optimize edilmiş yüksek verimli nucleofection protokol sunuyoruz. Biz daha başarılı bir şekilde hedef gen, mRNA ve protein seviyeleri hem de Rig-I siRNA susturulması için kanıt sağlar.
Abstract
Dendritik hücreler (DC), bağışıklık sisteminin başlatılması ve enfeksiyon 1 yanıt kritik bir rol oynayan nöbetçi olarak kabul edilebilir . Naif DC'ler tarafından patojenik antijen tespiti, patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPS) olarak adlandırılan özel korunmuş yapıları tanıyamaz örüntü tanıma reseptörleri (PRRs) geçer. DC'ler tarafından PAMPs Algılama olgun DC'lere aktivasyon ve dönüşüm sonuçlanabilecek bir hücre içi sinyal basamaklarını tetikler. Bu süreç genellikle diğer proinflamatuar sitokinlerin birlikte, tip 1 interferon üretimi ile karakterize, olgun T hücreleri ile etkileşim adaptif immün yanıt 2 başlatır drenaj lenf düğümleri, DC MHCII ve CD86 ve göç gibi hücre yüzey belirteçlerinin upregülasyonunun 3. Bu nedenle, DC'ler doğal ve adaptif bağışıklık sistemi bağlantısı.
Çeşitli patojenler DC tepkisi altında yatan moleküler ağlar incelemek için yetenek bu sinyal yollarının düzenlenmesi ve kaynaklı genlerin daha iyi anlaşılması için çok önemli. Bu aynı zamanda bulaşıcı hastalıklar ve tümörlere karşı DC tabanlı aşılar gelişimi kolaylaştırmak için yardımcı olacaktır. Ancak, bu araştırma çizgi ciddi zorluk birincil DC'ler 4 transfecting engellemiştir.
Virus lentiviral sistemi olarak iletimi yöntemleri, tipik olarak kullanılır, ancak bu karmaşıklık ve biyo-tehlikeli bir risk (ilgili maliyetler) 5,6,7,8 gibi birçok sınırlamalar taşır. Ayrıca, viral gen ürünleri teslim DC'ler 9,10,11,12 transduced immünojenite artar. Elektroporasyon karışık sonuçlar 13,14,15 ile kullanılan, ancak biz, yüksek verimli bir transfeksiyon protokol kullanım raporu ve kesin kendi programını göstermek için ilk olmuştur.
Bu yazıda, sınırlı hücre toksisitesi ve DC olgunlaşma (16) yokluğu, insan birincil DC'ler yüksek verim transfeksiyon için optimize edilmiş bir ticari protokol özetleyebiliriz . Transfeksiyon verimlilik (plazmid GFP) ve hücre canlılığı fazla sırasıyla% 50 ve% 70 idi. QRT-PCR IFNβ hiçbir upregülasyonu gösterdi FACS analizi, transfekte hücrelerde olgunlaşma belirteçlerinin CD86 ve MHCII ifade artış olmaması kurdu. Bu elektroporasyonu protokolü kullanarak, başarılı transfeksiyon DC'ler siRNA ve etkili hedeflenen gen yıkmak için kanıt sağlamak Rig-I mRNA ve protein seviyeleri hem de kilit bir virüs tanıma reseptör 16,17,.
Protocol
1. Programı Amaxa 96 servis Nucleofector
- Yeni bir parametre dosyasını açın.
- 96 plaka şeması üzerine imleci sürükleyerek standart transfeksiyon için kullanıyor olacak kuyuların sayısını seçin. Havuza her bir deney numune için en az 3 kuyu kullanın.
- Giriş program kodu: part1 seçin 'FF' ve part2 seçin '168 'aşağı çekme menüler
- Çözüm kutusunu seçin 'Monosit, insan'
- Kontrol Seçeneği altında 'Standart' seçeneğini seçin.
- Uygula tıklayın.
- Transfeksiyon kontrolü için gereklidir ve daha sonra Kontrol Seçenek 'No Program Kontrol seçin ve Uygula tıklayın şemada daha kuyuları seçin.
- Plaka diyagram üzerinde kalan kullanılmayan kuyu seçin ve undefine üzerine tıklayın.
2. DC'ler transfeksiyon için hazırlayın
- Tüm çalışmalar, mümkünse bir hücre kültürü kaputu steril koşullar altında yapılmalıdır. Ekleyerek nucleofection çözüm hazırlayın 96-450 2025 oranında İnsan Monosit 96-iyi Nucleofector Çözüm için ek. Mix ve oda sıcaklığına kadar ısınmasını bekleyin. Ortalama nucleofection çözüm 20μl gerek. % 10 aşırı hata pipetleme için izin olun.
- 1 ve 2 satır ilki takmadan doğru yönde yani nucleocuvette plakasına ihtiyaç nucleocuvette modülleri sayısı yerleştirin.
- Deney, 10 dakika süreyle 400g santrifüj iyi ve pelet ortalama 500.000 hücreleri hesaplamak için gerekli DC'ler sayısını belirler. Süpernatantı dikkatlice çıkartın.
- Hafifçe birkaç kez aşağı yukarı pipetleme ve nucleofection çözüm hücrelerin tekrar
- Yeniden süspanse hücreleri belirli bir tedavi örneğin GLO ve Rig-I etiketli eppendorfs içine doğru miktarda bölün.
- Pipetleme 500.000 hücreleri ve karışım başına 0.25μg siRNA ekleyin. No-transfeksiyon kontrol örneği olmayan hedef siRNA kullanın.
- Deneme düzeni göre nucleocuvette modüller halinde yukarıdaki karışımları Pipet 20μl, sıvı sağlayan kuyunun dibine teslim edilir.
- Kapaklı nucleocuvette plaka Kapak ve hava kabarcıklarının çıkarılması yardımcı olmak için birkaç kez sert bir yüzeye plaka dokunun.
3. Transfect DC'ler
- Plaka Nucleofector 96-iyi bir servis tepsisine yerleştirin Yükle tıklatın ve sonra başlayabilirsiniz.
- Lap top ekranda transfeksiyon sürecinin ilerlemesini takip, kırmızı zemin üzerine siyah bir çubuk başarısız olduğu anlamına gelir, oysa yeşil bir arka plan üzerinde siyah haç, çok iyi başarılı bir transfeksiyon anlamına gelir.
- Transfeksiyon sürecinin tamamlanmasından sonra, plaka kaldırmak ve her biri de çok kanallı pipet kullanarak DC büyüme orta 80μl ekleyin.
- 37 ° 10 dakika plaka ° C'de ve% 5 CO 2.
- Doğru yönünü koruyarak, nucleocuvettes 100μl hacmi, önceden ısıtılmış DC büyüme orta 100μl içeren matris tüpler içine aktarın.
- Transfeksiyon meydana gelmedi bu tüpleri çıkarın ve atın.
- 37 ° ° C'de ve% 5 CO 2, 24 saat veya diğer istenilen zaman aralığı için .
4. NDV ile hücreleri enfekte
- Eppendorfs her deneysel örnek inkübatör hücre kültürü kaput ve havuz tüpleri matris tüpleri çıkarın
- Pelet hücreler yavaşça 5 dakika için bir masa üstü santrifüj iplik ve süpernatant kaldırmak.
- 1 bir İçişleri Bakanlığı NDV içeren serum büyüme ortamda hücrelerin yeniden süspanse edin ve 37 inkübe ° C ve gevşek steril bir moda kapalı eppendorfs% 5 CO 2, 45 dk.
- 8-10 saat DC büyüme orta 900μl ve yeniden inkübe ekleyin
5. Hasat hücreleri
- Iplik ve bir masa üstü santrifüj eppendorfs süpernatant kaldırmak Pelet hücreleri.
- RNA ve protein izolasyonu protokole göre Hasat hücreleri.
6. Temsilcisi sonuçları:
Bizim optimize protokolünü kullanarak DC'ler transfekte Rigi-hedef interferon yanıtı yol uyarmak için NDV (RIG-I tarafından tespit Paramyxovirus) ile hücreleri enfekte sonra 24 saat siRNA ve. QRT-PCR analizi biz gen transkripsiyon seviyesinde% 75 oranında yıkmak gösterdi. Biz de IFN sinyalizasyon kaskad RIG-I downstream efektör IFNβ ifade benzer bir azalma gözlemledik. Ayrıca, MXA IFNβ mansap yanıt gen, (Şekil 1A) minimum iken enfekte olmayan, kontrol transfekte hücrelerinde IFNβ ifade algılanamaz olduğunu gözlemledik.
Ile DC'ler ikinci bir transfeksiyon Rigi hedef siRNA Western blot analizi için yeterli hücre kullanılarak yapıldı. NeredeRT-PCR sonuçları ile benzer bulunmuştur (yıkmak RIG-I ve IFNβ ifade sırasıyla% 62 ve% 66) daha önce gördüm (Şekil 1B), Western Blot bu gen ekspresyonu ortaya konmuştur I-Rig probed (Şekil 1C) tamamen engelledi.
Şekil 1. (A) MoDCs ya siRNA hedef ile transfekte Rig-I veya QRT-PCR ile tespit Rig-I, IFNβ ve MXA ifade nonspesifik GLO siRNA ve etkisi. (-) Transfeksiyon protokolü monosit özel bir tampon ve nucleoporation programı FF168 (Lonza Walkersville A.Ş.) 24 saat süreyle takiben kuluçka transfekte hücreler ya NDV (+) veya sol bulaşmamış ile enfekte edildi. 10 saat süreyle bir başka inkübasyondan sonra, hücreler toplandı ve RNA ekstrakte Transkript seviyeleri iki çoğaltmak deneylerin sonuçlarını temsil edildi. Bowles ve ark 16 alınan (B) Şekil 1A için kullanılan farklı bir buffy coat elde MoDCs tekrar ile transfekte ya Rig-I-siRNA veya nonspesifik GLO siRNA Yukarıdaki gibi aynı transfeksiyon protokolü kullanılarak hedef. Untransfected MoDCs kullanan bir ek kontrol deneyi içine dahil oldu. 24 saat inkübasyondan sonra tüm hücreleri NDV ile enfekte ve RNA ve protein izolasyonu için hasat edilmeden önce bir 10 saat daha inkübe edildi. Rig-I IFNβ QRT-PCR ile belirlenen MXA transkript seviyeleri iki çoğaltmak deneylerin sonuçları temsil eder. Bowles ve ark 16 Taken (C) Şekil 1B de yukarıda açıklanan hücrelerden lizatları Western blot ile analiz edildi. Untransfected hücreleri lizatları Lanes 1 ve 2, 3 ve 4 şeritli GLO siRNA transfekte hücreler lizatları şeritleri 5 ve 6, Rig-I-hedef siRNA transfekte hücreler lizatları. Örnekler RIG-I probed ve aynı zamanda GAPDH (bir yük kontrolü gibi) ve iki nüsha halinde çalışır. Bowles ve ark 16 alınmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verimli naif birincil dendritik hücrelerin transfeksiyon, yüksek verimlilik analizi ve, doğuştan gelen adaptif bağışıklık geçiş aracılık bu anahtar hücre, hücresel inflamatuar yollarının tersine mühendislik için önemlidir. Ancak, çoğu araştırmacı bu hücrelerin standart transfeksiyon teknikleri kullanarak hem verimli ve transfeksiyon prosedürü inducing hücre olgunlaşması olmadan transfect zor olduğunu bulabilirsiniz. Bu sınırlamalar, eş zamanlı, bağımsız bir 96-iyi ticari nükleer transfeksiyon sistemi (Lonza) kullanarak yüksek verim protokol optimizasyonu ile aşılabilir olmadığını araştırdık.
Floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanarak, GFP ifade transfeksiyon verimliliği ve bir hücrenin olgunlaşma okuma olarak CD86 ve MHCII immünoreaktivite bir marker olarak plazmid ölçülür. Sonuçta>% 50 transfeksiyon ve olgunlaşma belirteçlerinin artış olmaması gösteren koşullar belirlenmiş tamponlar ve elektroporasyon programlarının değerlendirilmesi deneylerin bir dizi.
Nucleofection süreci daha DC'ler mümkün aktivasyonu araştırmak için mRNA düzeyinde IFNβ ekspresyon düzeyleri ve onun downstream tepki gen MXA analiz MXA ifade IFNβ üretim zarif hassas ve çok düşük seviyelerde tespit etmek için bir biyoassay olarak kullanılabilir cytokine18. Mah-PCR analizi sayesinde saptanabilir IFNβ ifade gördüm ama MXA böylece yukarıda bazal IFNβ indüksiyon gösteren bazı upregülasyonu gördün. Ancak enfekte olmayan, kontrol transfekte hücrelerinde MXA bu minimal upregülasyonu IFNβ sinyal kaskad (Şekil 1A) virüs aracılı stimülasyon kaynaklanan kıyasla yok denecek kadar azdı ve başarıyla aktive olmadan DC'ler transfect nucleoporation protokolünü kullanmak doğruladı herhangi bir anlamlı düzeyde.
Bizim optimize protokol programı Western Blot analizi ile teyit edilmiştir. SiRNA hedef Rig-I saptanabilir Rig-I protein (Şekil 1C) tam bir kaybına neden oldu. DC'ler Transfeksiyon Biz diğer genlerin başarılı pertürbasyon, siRNA miktarı ve transfeksiyon zaman uzunluğu optimize edilmesi olabilir dikkat etmelisiniz.
Bildiğimiz kadarıyla, bu çalışmanın, böylece bu alanda araştırma için zor bir engel çözme ilk kez primer insan DC'ler yüksek verimlilik kaybı fonksiyon testleri tasarım sağlar. Bu DC sinyal çalışma için yeni fırsatlar sunmak ve DC-tabanlı Tedaviler geliştirme ilerlemesine katkıda bulunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Proje NIH NIAID Sözleşme No HHSN2662000500021C tarafından desteklenmiştir. Ming Chen Biz onun teknik destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza Inc. | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza Inc. | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
- Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
- Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
- Aicher, Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
- Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
- Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
- Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
- Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
- Roth, Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
- Tendeloo, V. F. V. an Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
- Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
- Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
- Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
- Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
- Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).
