Summary
ネズミ鞭虫の感染は、抵抗性のマウスは、保護のTh2応答を生成し、影響を受けやすいマウスは、病理学的Th1応答を生成するTh2の免疫の腸のモデルです。
Abstract
ネズミ鞭虫はネズミの天敵病原体であり、ヒトや家畜1を感染させる鞭の種の生物学的および抗原的に類似しています。感染卵を経口胃管栄養法、遠位小腸で孵化によって与えられる、環境1に線が盲腸の陰窩と近位結腸そのと成熟時に腸上皮細胞（IECS）ワームのリリースの卵に侵入する。このモデルは、コントロールのCD4 + Tヘルパー（Th）細胞の活性化だけでなく、腸上皮の変化その要因を調べるために強力なツールです。このようなC57BL / 6およびBALB / cのような耐近交系、で発生する免疫応答が、Th2の偏サイトカイン（IL - 4、IL - 5およびIL - 13）とTh1細胞関連サイトカイン間（ILワームの追放によって特徴付けられる-12、IL - 18、IFN -γ）遺伝的に感受性のAKR / Jマウス2-6の慢性感染を促進する。 Th2サイトカインが急速IECSの売上高、杯細胞の分化、募集およびワームの追放7-15に関与しているすべてが上皮透過性と平滑筋収縮の変化、を含む腸内微小環境における生理学的変化を促進する。ここでは詳細にその後の実験で使用することができるネズミ鞭虫の卵を伝播するためのプロトコルを。我々はまた、感染後の分析のための提案をサンプル実験的な収穫を提供しています。全体的に、このプロトコルは番目の消化管における傾向と同様にIECSの免疫エフェクター機能に関係する質問に対処するために使用することができるネズミ鞭虫のマウス感染モデルを実行するための基本的なツールを研究者に提供します。
Protocol
1。伝播するネズミ鞭虫の卵
- （または遺伝的に感受性のあるマウスネズミ鞭虫の卵の新しいバッチを生成するには、20〜30免疫不全マウスに感染（）例：NOD.Cg - Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ（NSG）または129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa（RAG2 - - /）例：。経口胃管栄養法により約300ネズミ鞭虫の卵を6〜8週間経過しているAKR / J）。
- 32から35日後にCO 2窒息によりマウスを犠牲にする。
- マウスの腹側を露出させ、70％エタノールで腹部を濡らす。
- 鉗子を使用すると、腹部の皮膚をつかんで、はさみを使って小さな切開を行います。腹部の内容を公開するために皮膚を切り取ります。
- 盲腸と近位大腸を識別し、それらを削除します。
- 500 U / mlペニシリンおよび500μg/ mlのストレプトマイシン（P / S）とダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を含む10cmペトリ皿に盲腸と近位大腸に置きます。ルーメンとワームを公開するオープンな盲腸を切る。リン酸のビーカーに鉗子の場所の盲腸を使用して、緩衝食塩水（PBS）と糞を除去するために振とうする。
- ペトリ皿に盲腸を返し、ゆっくりとワームを引き出し、DMEM + P / Sの5mlのを含む6ウェルプレートのウェルに配置滑らかな曲面鉗子（Roboz RS - 5047）を使用して
- マウスのすべてに対してこのプロセスを繰り返します。
- 37℃湿度とインキュベートを維持するために湿らせたペーパータオルで4時間のためのCでタッパーウェアの容器で6ウェルプレートを置く。
- 4時間は滑らかな曲面鉗子を使用してワームを削除し、5mLのDMEM + P / Sを含む6ウェルプレートの2つの新しい井戸に分割して後15ミリリットルファルコンチューブにオリジナルも、場所の内容を取得する。 4時間の抗原（典型的なタンパク質の収量が20匹あたり10から20ミリグラムであるPBS透析、後の細胞の再刺激のために使用することができる）を再懸濁しますとして3000rpmで取り外しおよび予備清でチューブを回転させて卵を含むオートクレーブした水道水でペレットを。
- 37℃で一晩戻し、6ウェルプレートを置く。取り外して、ワームを処分。ファルコンチューブ、5分間3000rpmでスピンに井戸の内容を取得する。一晩抗原として上清と予備を削除する（典型的なタンパク質の収量が20匹あたり10から20ミリグラムであるPBS透析、後鞭のAg特異的抗体のアイソタイプELISA法に使用することができる）と懸濁しますのオートクレーブ水道水でペレットを卵を含む。
- 4時間と一晩卵を結合し、残ったワームを削除するには、70μmストレーナーを通して卵をフィルタリングするには、75 cm 2のフラスコに移す。室温（RT）で6週間のための箔で覆われた暗い場所でフラスコをしてください。
- オートクレーブした水道水に卵を洗うと50μlの50現実的な卵で懸濁します。これを行うには、〜50ミリリットル滅菌水道水で5分間懸濁し、3000 rpmで卵を遠心する。スライドガラス上に50μlの卵と場所を削除します。 40倍の倍率を使用すると、50μlの実行可能な孵化卵の数を数えます。 50μlの50実行可能な卵を与えるために卵を希釈する。実行可能な卵のイメージのためにコッパーとマンスフィールド16でスタディを参照してください。
2。 ネズミ鞭虫卵（200卵/マウス）と実験用マウスの急性感染
- 徹底的に再懸卵とは、マウスの数を治療するために十分なボリュームを削除してX 2（例えば10匹に対して200μlのX線写真を撮る10匹× 2 = 4卵のMLS）と14mlのスナップキャップチューブに配置。
- ミックスに14mlのスナップキャップチューブを反転。適切なサイズの餌針で1mlのシリンジ（25グラムのマウスを、私たちは18ゲージ1 1 / 2を使用する"針）に卵液200μlを立ち上げます。片方の手の首筋には、マウスや他の手を使っての強制経口投与による卵の管理。
- 21日待ってください。
3。実験的な収穫
- 21日目にCO 2を使用してマウスを生け贄に捧げる。
- 心臓穿刺によりマウスから血液を収集し、非ヘパリンシリンジで、そして4℃で保存します。次の日は、-20℃で血清と凍結を分離血清は、ELISAによって鞭特異IgGをおよびIgEの検出に用いることができる。
- マウスの腹側を露出させ、70％エタノールで腹部を濡らす。
- 鉗子を使用すると、腹部の皮膚をつかんで、はさみを使って小さな切開を行います。皮膚や腹部の内容を公開するために、基礎となる膜を切り取ります。
- 小腸、盲腸および結腸を識別します。ピンセットで盲腸を取得し、腹腔から引き出します。鉗子の別のペアで腸間膜リンパ節（mLNs）を公開し、右に小腸を押してください。メディアの2 MLSを含む15 50mlファルコンの腸と場所にカットしないように注意しながらmLNsを削除します。これらは、必要なら、ELISAおよび細胞内のfでサイトカインの解析のための72時間処理し、in vitro（1μg/ mlのαCD3/CD28付きまたは50μg/ml4H 鞭銀の24ウェルプレートに1 mlの4 × 10 6個 / ml）で再刺激することができますローサイトメトリー。
- 盲腸と大腸を切り取る。
- 鉗子を使用して、2 mlのAxygenチューブの遠位結腸と場所から糞を押し出す。 -20℃で凍結糞は、レジスチン様分子-β（RELM -β）の発現のためのウェスタンブロットによって分析することができます。
- 盲腸（〜0.5 cm）の先端を取り外します。糞便を削除するにはピンセットで盲腸の先端を保持し、PBSはペトリ皿に3 mlのシリンジと22ゲージの針を使用して洗い流してください。 5ミリリットルファルコンのスナップキャップチューブに新鮮な4％パラホルムアルデヒドで場所。 4℃で保存します。これらはパラフィン包埋、切片と組織学的分析のためのスライド上にマウントすることができます。
- RNAのための近位結腸の一部（〜1 cm）を取り外します。 500μlのRNAlater中で2ml Axygenチューブにサンプルを置く。 4℃で保存します。これらのサンプルは、定量PCRによるmRNAの発現について分析することができる。
- -20℃でラベルされたペトリ皿や凍結で盲腸の残りの部分を置き
4。盲腸のネズミ鞭虫ワームの列挙
- 〜5 mlの水を含むペトリ皿で冷凍し、場所から盲腸を削除します。
- はさみを使用して、内腔を公開するオープンな盲腸を切る。
- 鉗子で盲腸を持ち、精力的に糞便の大半を除去するために盲腸を振る。
- 水を含むと優しくIECSの基盤となる組織を掻き滑らかな曲面鉗子を使用して別のシャーレに盲腸を転送する。
- 水を含む新しいペトリ皿に盲腸を移し、精力的に小さい部分にティッシュをリッピング、ピンセットで残りの組織を削る。
- シャーレのすべての3でワームのすべてをカウントする解剖顕微鏡を使用してください。このワームは、同じワームを確実にするために皿からそれを削除見つけるの倍カウントされません。ワームが損傷している場合（すなわち半分に壊れて）正確なカウントを取得する唯一の厚いまたは薄い端を数える。
5。代表的な結果
ネズミ鞭虫の感染モデルでは、研究者が寄生虫の負担と全身免疫応答だけでなく、組織学的に調べるために遠位の盲腸内の炎症反応を定量化することができます。収穫盲腸の内腔が露出されると、 鞭のワームは、解剖顕微鏡（図1A - B）を使用して列挙することができます。 鞭への免疫のパラメーターにも影響を受けやすい動物に抵抗性動物のIgG1の（Th2型の免疫に関連する）、およびIgG2a（Th1型の免疫に関連する）に切り替える抗体のアイソタイプ（図1C）が含まれています。杯細胞特異的タンパク質レジスチン様分子-β（RELM -β）の発現は、 鞭のクリアランスに関連付けられており、ウェスタンブロット解析（図2）で検出可能です。盲腸の先端部分は、杯細胞の応答と感染症（図3）に対応して腸の炎症の程度を評価するために過ヨウ素酸シッフ（PAS）で染色することができます。
図1。 ネズミ鞭虫への耐性の定量化 。 （A）抵抗性（B6）マウスは、21日後に感染により鞭のムリスを追放。これとは対照的に、影響を受けやすい（AKR / J）マウスは、寄生虫の確立で、その結果、 鞭で慢性的に感染する。各バーは平均±グループごとに4-8のSEMは、動物を表しています。 （B）ワームは、解剖顕微鏡を使ってカウントされます。トップパネルが単独でワームを示し、下部パネルには、IECSと糞の存在下でワームを示しています。 （C） 鞭 -特異的IgG2a力価は、排泄の鞭の抗原（O / N銀、5μgの/でコーティングしたプレートに希釈した血清のELISA（1:2希釈、1:20希釈から始まると1:2560で終わる）によって決定されますml）を。感受性のAKR / Jマウスは抵抗性B6マウスよりも鞭特異的血清IgG2aの特に高いレベルを持っている。
図2。 ネズミ鞭虫のクリアランスは、杯細胞特異的タンパク質のRELM -β7の発現に関連付けられています 。 RELMは、-βの生産は、ウェスタンブロット分析によって鞭感染抵抗性（B6）ではなく、影響を受けやすい（AKR / J）マウス由来の糞から検出することができます。各レーンは、（N）=ナイーブ、（TM）= 21日間の鞭感染したマウスの単一動物の代表です。
図3。遠位盲腸以下の鞭の感染症の組織学的検査 。遠位盲腸5-7μmのセクションでは、PASで染色。杯細胞の過形成と粘液産生は、耐性（B6）で明らかですが鞭の感染後のマウスを（AKR / J）影響を受けることはありません。
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Discussion
このプロトコルは、詳細調査員の必要に応じて変更できます標準の高用量急性ネズミ鞭虫の感染を。例えば、マウスを屠殺することができ、組織は別の日に収穫。マウスが正常に完全なワームの負担が確立されていることを決定するために、それらはすべてマウスでは約200ワームの重荷を運ぶ必要のある時点で、14日目に犠牲にすることができます。マウスはまた、検出されたワームが成熟に達しているし、その寿命の間にホストにとどまると32日間感染することができます。さらに、プロトコルは、慢性的なネズミ鞭虫の感染をモデルに適応させることができます。そのためには、投与卵の用量は低用量の感染症（約30卵）に調整することができます。この投与量で、通常は抵抗性のマウスは、保護のTh2応答を誘導するために失敗するのではなく、Th1反応を生成し、約20ワーム17の負担を維持する。
他の感染症のモデルに比べネズミ鞭虫の感染モデルの利点の一つは、一般的に感染したマウスは、任意の罹患率や死亡率を示さないことです。研究者は注意する必要のある実験結果に影響を及ぼすことの要因は、しかし、があります。第一の要因は、マウスのバックグラウンド株である。として結果で概説したように、C57BL / 6マウスは抵抗性があり、AKR / Jマウスは敏感です、そして、同様に、他の近交系は、さまざまな感染症のプロファイルを持つことができます。したがって、研究者が自分のマウスのバックグラウンド株の認識と適切な対照マウスを使用することが重要です。いくつかは通常耐コントロールマウスは、ポスト感染21日で30ワームまである場合は心配する必要はありませんので、さらに、寄生虫クリアランスのマウスからマウスのばらつきがある場合もあります。同様に、影響を受けやすいマウスは常に完全な200カウントワームの負担を維持することはありませんが、盲腸あたり約75〜200ワームの範囲です。この変化はまた別の施設に収容されたマウスの腸内フローラにおける自然変動で説明されることができる。
悪影響ネズミ鞭虫の感染に影響を与える要因は、蟯虫の存在です。蟯虫は鞭と同じ解剖学的部位に感染し、 鞭の研究の解釈を混乱させることができる免疫応答を誘発する。さらに、蟯虫の治療（アルベンダゾール、フェンベンダゾール）も鞭を殺す。この実験的な手順では、我々は、特定病原体フリーの条件下で維持されているマウスを使用して、そしてそれは、実験用マウスは、前にネズミ鞭虫の感染症へと中に蟯虫が自由保たれることは、重要です。
いくつかのマイナーなポイントの研究者は注意する必要があります。
- 卵は水ではなく、PBSで維持されるべきである。
- 卵は非常に重いですので、各マウスに配信される前に再懸されるべきである。また、彼らは注射器で解決されるように、一度にマウスを感染させるために卵の唯一の十分なボリュームをロードする。
- いくつかのまれな菌株は感染性の性差を示すが、ほとんどのケースでは、男性または女性いずれかがネズミ鞭虫の感染に使用することができます。
- このモデルで感染の水平伝達の心配がないので、ナイーブマウスに感染したマウスと同じケージに収容することができます。
全体的に、 ネズミ鞭虫の感染はTh2 -依存性の免疫そのモデルを実行する手順は簡単ですし、個々の研究者のニーズに合わせて適応させることができます。
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Disclosures
動物実験は、ブリティッシュコロンビア大学で定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。
Acknowledgments
この作品は、カナダ衛生研究所（MSH - 95368、MOP - 89773とCZのMOP - 106623）とイノベーションのためのカナダ財団によってサポートされていました。 SCMは、消化器ポスドクのCIHR /カナダの協会の受信者です。 CZはCIHR新しい研究者でもある。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles (18 x 1½") | Popper & Sons, Inc. | 7912 | |
| Smooth curved Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5047 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | Jackson Laboratory | 005557 | These are the mice we used, however, any immunodeficient mice or susceptible strain should work. |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | |
| 2 ml tubes | Axygen Scientific | MCT-200-C | |
| 15 ml tubes | Falcon BD | 352096 | |
| 6 well plates | Falcon BD | 353046 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-RELMβ antibody | PeproTech Inc | 0694270Rb |
References
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