Summary
Trichuris Muris инфекция кишечная модель Th2 иммунитет, где устойчивы мыши генерировать защитный Th2 ответа и восприимчивы мыши генерировать патологических Th1 ответа.
Abstract
Trichuris Muris является естественным возбудителем мышей и биологически и антигенно похожи на виды Trichuris, поражающих человека и домашнего скота 1. Инфекционный яйца даются устные желудочный зонд, люк в дистальных отделах тонкой кишки, проникают в эпителиальные клетки кишечной (IECS), что линия склепы слепой кишки и проксимальной толстой кишки и при созревании червей выпуск яиц в окружающую среду 1. Эта модель представляет собой мощный инструмент для изучения факторов, которые контролируют CD4 + Т-хелперов (Th), активации клеток, а также изменения в кишечном эпителии. Иммунного ответа, что происходит в устойчивых инбредных линий, таких как C57BL / 6 и BALB / с, характеризуется Th2 поляризованных цитокинов (IL-4, IL-5 и ИЛ-13) и изгнание червей в то время как Th1-связанных цитокинов (IL -12, Ил-18, ИФН-γ) содействовать хронические инфекции у генетически предрасположенных AKR / J мышей 2-6. Th2 цитокинов способствовать физиологические изменения в желудочно-кишечном микроокружения в том числе быстрый оборот IECS, дифференциация кубок клетки, найма и изменения в эпителиальной проницаемости и сокращение гладких мышц, которые были вовлечены в изгнание червя 7-15. Здесь мы подробно протокол за распространение Trichuris Muris яиц, которые можно использовать в последующих экспериментах. Мы также предоставляем сбора образцов экспериментальной с предложениями по пост-инфекции анализа. В целом, этот протокол будет предоставить исследователям с основными инструментами для выполнения мыши Trichuris Muris инфекции модель, которая может быть использована для решения вопросов, связанных с Th склонности в желудочно-кишечном тракте, а также иммунные эффекторные функции IECS.
Protocol
1. Распространение Trichuris Muris яйца
- Для создания новых партий Trichuris яйца Muris, заразить 20-30 иммунодефицитных мышей (например, NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ (ГЯП) или 129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa (RAG2 - / -)) или генетически предрасположенных мышей ( например. AKR / J), которые 6-8 недель с примерно 300 Trichuris Muris яйца устной желудочный зонд.
- После 32-35 дней жертву мышей CO 2 удушья.
- Expose брюшной стороне мыши и мокрого живота с 70% этанола.
- Использование щипцов понять кожи живота и сделать небольшой разрез с помощью ножниц. Разрежьте кожу подвергать содержимого брюшной полости.
- Определить слепой кишки и проксимальной толстой кишки, и удалить их.
- Место слепой кишки и проксимальной толстой кишки в 10 см Петри содержащие Дульбеко изменения Eagle Средняя (DMEM) с 500 ед / мл пенициллина и 500 мкг / мл стрептомицина (P / S). Вырезать слепой кишки открытым раскрыть просвет и червей. Использование щипцов место слепой кишки в стакане фосфатным буферным раствором (PBS) и встряхните осторожно, чтобы удалить фекалии.
- Вернуться слепой кишки к чашке Петри и используя гладкие изогнутые щипцы (Roboz RS-5047) осторожно извлеките червей и поместите их в скважины 6-луночный планшет, содержащий 5 мл DMEM + P / S.
- Повторите этот процесс для всех мышей.
- Положите 6 и пластинку в контейнер Tupperware с влажным бумажным полотенцем, чтобы сохранить влажность и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 4 часов.
- После 4-х часов удалить червей использующих гладкую изогнутую щипцов и разделить их на 2 новых скважин 6 хорошо пластину, содержащую 5 мл DMEM + P / S. Урожай содержимое исходного хорошо, и место в 15 мл трубки сокола. Спиновые трубки при 3000 оборотах в минуту и удалить супернатант и резервные как 4 часа антигена (может быть использована для сотовых рестимуляции после PBS диализа, где типичная дает белка 10-20 мг в 20 мышей) и ресуспендируйте яйцо содержащих гранулы в автоклаве водопроводной воды.
- Положите 6 лунками назад на 37 ° С в течение ночи. Удаление и захоронение червей. Урожай содержимое лунок в трубку сокола и спина при 3000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Удалить супернатант и запас в ночь антигена (может быть использован для Trichuris Ag конкретных ИФА изотипа антител после PBS диализа, где типичная дает белка 10-20 мг в 20 мышей) и ресуспендируйте яйцо содержащих гранулы в автоклаве водопроводной воды.
- Комбинат 4 часа и ночевка яйца и фильтр яйца через сито 70μm чтобы удалить все посторонние червей затем перенести в 75 см 2 колбы. Держите колбу в темное место покрыты фольгой в течение 6 недель при комнатной температуре (RT).
- Мойте яйца в автоклаве водопроводной воды и ресуспендируют в 50 жизнеспособных яиц в 50 мкл. Чтобы сделать это, центрифуги яйца со скоростью 3000 оборотов в минуту в течение 5 минут и ресуспендируют в ~ 50 мл стерильной водопроводной воды. Удалить 50 мкл яйца и поставьте на стекле. Использование 40-кратном увеличении подсчитать количество жизнеспособных эмбрионов яиц в 50 мкл. Развести яйца, чтобы дать 50 жизнеспособных яиц в 50 мкл. Для изображений, жизнеспособных яиц см. исследование Коппер и Мэнсфилд 16.
2. Острая инфекция экспериментальных мышей с Trichuris Muris яйца (200 яйца / мышь)
- Тщательно ресуспендирования яйца и удалить достаточный объем для лечения число мышей X 2 (например, для 10 мышей взять 200 мл х 10 мышей х 2 = 4 мл яйца) и поместите их в 14 мл трубки колпачок оснастки.
- Обратить 14 мл оснастки колпачок трубки перемешать. Доведите до 200 мкл яйца в 1 мл шприц на иглу соответствующего размера кормления (для мышей весом 25 грамм мы использовали 18 калибра 1 1 / 2 "игл). В одной руке загривок мыши и используя другой стороны администрировать яйца устно зонд .
- Подождите 21 дней.
3. Экспериментальные урожая
- На 21-й день жертву мышей использованием CO 2.
- Сбор крови мышей, пункции сердца, не в гепаринизированной шприц, и хранить при температуре 4 ° C. На следующий день изолировать сыворотке и замерзает при -20 ° C. Сыворотку можно использовать для обнаружения Trichuris конкретных IgGs и IgE методом ИФА.
- Expose брюшной стороне мыши и мокрого живота с 70% этанола.
- Использование щипцов понять кожи живота и сделать небольшой разрез с помощью ножниц. Вырезать кожи и подлежащих мембраны подвергать содержимого брюшной полости.
- Определить тонкой кишки, слепой кишки и толстой кишки. Захватите слепой кишки пинцетом и вытащить из брюшной полости. С другой парой щипцов подтолкнуть тонкой кишки на правый подвергая брыжеечных лимфатических узлов (mLNs). Удалить mLNs тем, чтобы не врезаться в кишечнике и место в 15 мл сокола, содержащий 2 мл СМИ. При желании они могут быть обработаны и restimulated в пробирке (4x10 6 / мл в 1 мл в 24-луночных планшетах с 1 мкг / мл αCD3/CD28 или с 50μg/ml 4h Trichuris Ag) в течение 72 часов для цитокинов анализ ИФА и внутриклеточных енизкий цитометрии.
- Вырежьте слепой кишки и толстой кишки.
- Использование щипцов, вытолкнуть фекальные пеллеты из дистальной толстой кишки и место в 2 мл Axygen трубки. Замораживание при -20 ° C. Фекальные гранулы можно анализировать с помощью иммуноблоттинга для выражения резистина-подобные молекулы-β (β-RELM).
- Удалите наконечник из слепой кишки (~ 0,5 см). Для удаления кала провести слепую кишку кончик пинцетом и на одном уровне с использованием PBS 3 мл шприца и 22-иглы в чашке Петри. Место в свежем 4% параформальдегида в 5 мл Сокол трубки колпачок оснастки. Хранить при температуре 4 ° С. Они могут быть парафин, секционные и установлен на слайды для гистологического анализа.
- Удалите часть проксимальной толстой кишки (~ 1 см) для РНК. Поместите образец на 2 трубки мл Axygen с 500 мкл RNAlater. Хранить при температуре 4 ° С. Эти образцы могут быть проанализированы на экспрессию мРНК КПЦР.
- Место остальной слепой кишки в меченых чашке Петри и заморозить при -20 ° C.
4. Перечисление Trichuris Muris червей в слепой кишке
- Удалить из слепой кишки морозильника и место в чашке Петри, содержащей ~ 5 мл воды.
- Использование ножницы, разрезать слепой кишки раскрыть просвет.
- Держите слепой кишки с щипцами и энергично встряхнуть слепой кишки, чтобы удалить большинство калом.
- Передача слепой кишки в другой чашке Петри, содержащей воду и с помощью гладкой изогнутыми щипцами аккуратно соскоблить IECS основной ткани.
- Передача слепой кишки к новой чашке Петри, содержащей воду и энергично скрести оставшиеся ткани щипцами, разрывая ткань на мелкие кусочки.
- Используйте рассекает микроскоп для подсчета всех червей в все 3 чашках Петри. Как вы нашли червя удалить ее с блюдом, чтобы обеспечить такой же червь не учитываются дважды. Если черви повреждены (т.е. сломанный пополам) рассчитывать только толстыми или тонкими концами, чтобы получить точный подсчет.
5. Представитель Результаты
Инфекции Trichuris Muris модель позволяет исследователям количественно паразита бремени и системные иммунные реакции, а также гистологическое изучение воспалительной реакции в дистальных слепой кишки. Когда просвет слепой кишки собрано подвергается, Trichuris черви могут быть перечислены использованием рассекает микроскопом (рис. 1А-Б). Параметры иммунитет к Trichuris также включают антитела изотипа переход на IgG1 (связанный с Th2-типа иммунитета) в резистентных животных, и IgG2a (связанный с Th1-типа иммунитета) у восприимчивых животных (рис. 1в). Выражение кубок клеточного специфического белка резистина-подобные молекулы-β (β-RELM) связан с оформления Trichuris и обнаруживается Вестерн-блот анализе (рис. 2). Дистальной части слепой кишки могут быть окрашены с периодическими кислотно-Шиффа (PAS) для оценки кубок клеточного ответа и степень воспаления кишечника в ответ на инфекцию (рис. 3).
Рисунок 1. Количественная оценка иммунитета к Trichuris Muris. (А) Устойчивость (B6) мышей изгнать Trichuris Muris днем 21 пост-инфекции. В отличие от этого, восприимчивых (AKR / J) мышей хроническую инфекцию Trichuris, в результате чего паразит учреждения. Каждая полоска представляет собой среднее ± SEM из 4-8 животных в группе. (B), черви считаются использованием рассекает микроскопом. Верхняя панель показывает червей в изоляции, нижняя панель показывает червей в присутствии IECS и калом. (C) Trichuris конкретных IgG2a титры определяются с помощью ИФА в сыворотке разбавленный (1:2 разбавление, начиная с 1:20 разбавления и заканчивая 1:2560) на пластинах покрыта выделительной Trichuris антигена (O / N Ag, 5 мкг / мл). Восприимчивые AKR / J мышей заметно выше уровней Trichuris конкретных сыворотке IgG2a, чем устойчивые B6 мышей.
Рисунок 2. Оформление Trichuris Muris связано с выражением кубок клеточного специфического белка RELM-β 7. RELM-β производства могут быть обнаружены фекальные пеллеты из Trichuris-инфицированных устойчивостью (B6), но не поддается (AKR / J) мышей западными блот-анализа. Каждая полоса представитель одного животного, (N) = Наивные, (т) = 21-дневный Trichuris инфицированных мышах.
Рисунок 3. При гистологическом исследовании дистальных слепой кишки после заражения Trichuris. 5-7 мкм разделы дистального слепой кишки окрашивали PAS. Кубок гиперплазии клеток и слизи очевидны в устойчивостью (B6), но не поддается (AKR / J) мышей после заражения Trichuris.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол детали стандартных высокие дозы острого Trichuris Muris инфекция, которая может быть изменена в соответствии с требованиями следователя. Например, мыши могут быть принесены в жертву и тканей собраны в разные дни. Установить, что мышей успешно создана всю тяжесть червя они могут быть принесены в жертву на 14 день, после чего все мыши должны нести бремя около 200 червей. Мыши могут быть также инфицированы в течение 32 дней, где любой червь обнаружен достигнет зрелости и будет оставаться в приемных в течение всего срока его службы. Кроме того, протокол может быть адаптирована к модели хронического Trichuris Muris инфекции. Для этого вводят яйцо доза может быть скорректирована с низкой дозы инфекции (около 30 яиц). При этой дозе, как правило, устойчивы мышей не в состоянии вызвать защитную Th2 ответа, а, скорее, генерировать Th1 ответа и поддерживать бремя примерно 20 червей 17.
Одним из преимуществ инфекции Trichuris Muris модели по сравнению с другими моделями инфекции, что в целом инфицированных мышей нет видимых заболеваемости и смертности. Существуют, однако, факторы, которые могут повлиять на экспериментальных результатов, которые исследователи должны знать. Первым фактором является фоном штамма мышей. Как отмечается в результатах, C57BL / 6 мышей, устойчивых и AKR / J мышей восприимчивы, и, аналогично, других инбредных линий может иметь различные профили инфекции. Поэтому важно, чтобы исследователь быть в курсе фоне штамм своих мышей и использовать соответствующие контрольных мышей. Кроме того, не может быть и мышь к мыши изменения паразита оформления, поэтому нет необходимости для беспокойства, если некоторые обычно устойчивы контрольных мышей иметь до 30 червей на 21 дней после инфекции. Кроме того, восприимчивых мышей не всегда будет поддерживать полный 200-червь считать нагрузку, но может колебаться от примерно 75 до 200 червей на слепой кишки. Этот вариант также может быть за счет естественного изменения в кишечной флоры мышей размещены в различных объектах.
Фактор, который отрицательно влияет на Trichuris Muris инфекции является наличие остриц. Острицы заразить же анатомические сайт как Trichuris и вызывают иммунный ответ, который может посрамить интерпретации Trichuris исследований. Кроме того, острицы лечение (альбендазол, фенбендазол) также убивает Trichuris. В этой экспериментальной процедуры, мы используем мышей, которые обслуживаются в рамках конкретных патогенов условиях свободного, и это имеет первостепенное значение, что подопытных мышей быть свободным остриц до и во время инфекции Trichuris Muris.
Некоторые незначительные исследователи пункты должны быть в курсе:
- Яйца должны быть сохранены в воде, а не ФСБ.
- Яйца очень тяжелый и поэтому должны быть ресуспендировали перед поставкой каждой мыши. Кроме того, загрузить только достаточного объема яиц, чтобы заразить одним щелчком в то время, как они будут селиться в шприц.
- Некоторые редкие штаммы показывают половые различия в инфекционной но в большинстве случаев, будь то мужчины или женщины могут быть использованы для Trichuris инфекций Muris.
- Наивные мыши могут быть размещены в одной клетке, как инфицированных мышей, пока это не касается горизонтального переноса инфекции с этой моделью.
В целом, Trichuris Muris инфекция простая процедура для выполнения этой модели Th2-зависимого иммунитета и могут быть адаптированы под индивидуальные потребности исследователей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Университета Британской Колумбии.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Канадского института исследований в области здравоохранения (MSH-95368, СС-89 773 и СС-106 623 в ЧР) и Канаде Фонд инноваций. СКМ является получателем CIHR / Канадская ассоциация гастроэнтерологов докторской стипендии. CZ является CIHR Новый следователь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles (18 x 1½") | Popper & Sons, Inc. | 7912 | |
| Smooth curved Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5047 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | Jackson Laboratory | 005557 | These are the mice we used, however, any immunodeficient mice or susceptible strain should work. |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | |
| 2 ml tubes | Axygen Scientific | MCT-200-C | |
| 15 ml tubes | Falcon BD | 352096 | |
| 6 well plates | Falcon BD | 353046 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-RELMβ antibody | PeproTech Inc | 0694270Rb |
References
- Cliffe, L. J., Grencis, R. K. The Trichuris muris system: a paradigm of resistance and susceptibility to intestinal nematode infection. Adv. Parasitol. 57, 255-307 (2004).
- Else, K. J., Finkelman, F. D., Maliszewski, C. R., Grencis, R. K. Cytokine-mediated regulation of chronic intestinal helminth infection. J. Exp. Med. 179, 347-351 (1994).
- Bancroft, A. J., Grencis, R. K. Th1 and Th2 cells and immunity to intestinal helminths. Chem. Immunol. 71, 192-208 (1998).
- Bancroft, A. J., McKenzie, A. N., Grencis, R. K. A critical role for IL-13 in resistance to intestinal nematode infection. J. Immunol. 160, 3453-3461 (1998).
- Helmby, H., Takeda, K., Akira, S., Grencis, R. K. Interleukin (IL)-18 promotes the development of chronic gastrointestinal helminth infection by downregulating IL-13. J. Exp. Med. 194, 355-364 (2001).
- Owyang, A. M. Interleukin 25 regulates type 2 cytokine-dependent immunity and limits chronic inflammation in the gastrointestinal tract. J. Exp. Med. 203, 843-849 (2006).
- Artis, D. RELMβ/FIZZ2 is a goblet cell-specific immune-effector molecule in the gastrointestinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 13596-13600 (2004).
- Datta, R. Identification of novel genes in intestinal tissue that are regulated after infection with an intestinal nematode parasite. Infect. Immun. 73, 4025-4033 (2005).
- Cliffe, L. J. Accelerated intestinal epithelial cell turnover: a new mechanism of parasite expulsion. Science. 308, 1463-1465 (2005).
- Artis, D. New weapons in the war on worms: identification of putative mechanisms of immune-mediated expulsion of gastrointestinal nematodes. Int. J. Parasitol. 36, 723-733 (2006).
- Finkelman, F. D. Cytokine regulation of host defense against parasitic gastrointestinal nematodes: lessons from studies with rodent models. Annu. Rev. Immunol. 15, 505-533 (1997).
- Grencis, R. K. Enteric helminth infection: immunopathology and resistance during intestinal nematode infection. Chem. Immunol. 66, 41-61 (1997).
- Khan, W. I. Modulation of intestinal muscle contraction by interleukin-9 (IL-9) or IL-9 neutralization: correlation with worm expulsion in murine nematode infections. Infect. Immun. 71, 2430-2438 (2003).
- Khan, W. I., Blennerhasset, P., Ma, C., Matthaei, K. I., Collins, S. M. Stat6 dependent goblet cell hyperplasia during intestinal nematode infection. Parasite Immunol. 23, 39-42 (2001).
- Akiho, H., Blennerhassett, P., Deng, Y., Collins, S. M. Role of IL-4, IL-13, and STAT6 in inflammation-induced hypercontractility of murine smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 282, 226-2232 (2002).
- Kopper, J. J., Mansfield, L. S. Development of improved methods for delivery of Trichuris muris to the laboratory mouse. Parasitol. Res. 107, 1103-1113 (2010).
- Bancroft, A. J., Else, K. J., Grencis, R. K. Low-level infection with Trichuris muris significantly affects the polarization of the CD4 response. Eur. J. Immunol. 24, 3113-3118 (1994).
