Summary
Trichuris muris 감염은 모성 쥐가 보호 Th2 반응을 생성하고 민감한 쥐가 병적인 Th1 반응을 생성하는 Th2 면역의 창자 모델입니다.
Abstract
Trichuris muris은 생쥐의 자연 병원체이며 인간과 가축 1 감염 Trichuris의 수종에 생물학과 antigenically 비슷합니다. Infective 달걀이 구두 gavage, 말초 소장에서 부화에 의해 부여됩니다, 라인 -이게 맹장과 근위 결장과 성숙시 crypts이 웜은 환경 1에 달걀을 풀어 그 창자 상피 세포 (IECs)를 침공. 이 모델은 요소를 검토하는 강력한 도구입니다 컨트롤 CD4 + T는 헬퍼 (TH) 세포 활성화뿐 아니라 창자 상피의 변화. 이러한 C57BL / 6 BALB / C와 같은 저항 근친 직전에 발생하는 면역 반응이 Th2 편광 크린 시토킨 (IL - 4, IL - 5, IL - 13)과 Th1 - 관련 크린 시토킨 동안 (IL 웜의 퇴학이 특징입니다 -12, IL - 18, IFN - γ) 유전자 취약 AKR / J 마우스 2-6에서 만성 감염을 추진하고 있습니다. Th2 크린 시토킨 신속 IECs의 매출, 고블렛 셀 차별화, 모집 및 상피 투과성 및 웜 퇴학 7-15에 연루되어 모든있는 평활근의 수축에 변화를 포함한 창자 microenvironment의 생리 변화를 추진하고 있습니다. 여기 자세히 후속 실험에서 사용할 수 Trichuris muris 달걀을 전파를위한 프로토콜을. 우리는 또한 이후의 감염 분석을위한 제안 샘플 실험의 수확을 제공합니다. 전반적으로,이 프로토콜은 위장관뿐만 아니라 IECs의 면역 이펙터 기능에 목 proclivity에 관한 질문을 해결하기 위해 사용할 수있는 Trichuris muris 마우스 감염 모델을 수행할 수있는 기본 도구와 연구자를 제공할 것입니다.
Protocol
1. Trichuris muris 달걀을 전파
- (또는 유전자 취약 마우스 Trichuris muris 달걀의 새로운 배치를 생성하려면, 20-30 immunodeficient 생쥐를 감염 () 예 NOD.Cg - Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) 또는 129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa (RAG2 - - /) 예. 경구 gavage으로 약 300 Trichuris muris 달걀과 6~8주 된 AKR / J).
- 32-35일 후 CO 2 질식하여 쥐를 희생.
- 마우스의 복부 측면을 폭로하고 70 %의 에탄올과 함께 복부가 젖었어.
- 사용 포셉은 복부 피부를 파악하고 가위를 사용하여 작은 절개를합니다. 복부 내용을 노출 피부를 잘라.
- 이게 맹장과 근위 대장을 식별하고 그들을 제거합니다.
- 500 U / ML 페니실린, 500 μg / ML 스트렙토 마이신 (P / S)와 Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM)을 포함 10cm 배양 접시에있는 맹장과 근위 대장를 놓습니다. 루멘과 벌레를 노출 열어이게 맹장을 잘라. 인산염의 비커에 포셉 플레이스이게 맹장을 사용하면 호수 (PBS)를 버퍼 및 배설물을 제거 부드럽게 발라줍니다.
- 페트리 접시에이게 맹장을 반환하고 부드럽게 벌레를 꺼내와 DMEM + P / S. 5 MLS를 포함하는 6 자 접시의 우물에 넣어 부드러운 곡선 포셉 (Roboz RS - 5047)을 사용하여
- 생쥐의 모든에 대해이 과정을 반복합니다.
- 37 습도와 부화를 유지하기 위해 젖은 종이 타월 ° 4 시간을위한 C와 유리 섬유 복합 컨테이너 6 잘 접시를 넣어.
- 4 시간은 부드러운 곡선 집게를 사용하여 웜을 제거하고 5mL DMEM을 포함하는 6 자 접시 중 2 개의 새 우물로 그들을 분할 후 + P / S. 15 ML 팔콘 튜브의 원래 잘 장소의 내용을 수확. 4 시간의 항원 (일반 단백질 수율 20 생쥐 10-20 MG 아르 PBS 투석 후 세포 restimulation에 사용할 수있는)과 resuspend로 3,000 RPM 및 제거하고 예비 뜨는에서 튜브를 회전 달걀이 포함된 autoclaved 수돗물에 펠릿합니다.
- ° C 야간 37 위로 여섯 잘 접시를 넣어. 제거 및 웜 처분. 팔콘 튜브 5 분 3,000 rpm으로 회전에 우물의 내용을 수확. 하룻밤 항원 (일반 단백질 수율 20 생쥐 10-20 MG 아르 PBS 투석 후, Trichuris 자세 특정 항체 isotype의 ELISAs에 사용할 수있는)과 resuspend 달걀 함유 autoclaved 수돗물에서 펠렛을 같이 뜨는하고 예약을 제거합니다.
- 4 시간과 야간 계란을 결합하고 75cm 2 플라스크에 전송 후 어떤 남은 웜을 제거하는 70μm 스트레이너를 통해 계란을 필터링합니다. 실온 (RT) 6 주 호일로 덮여 어두운 장소에 술병 보관하십시오.
- autoclaved 수돗물에 달걀을 씻어 50 μl 50 가능한 계란에서 resuspend. 이렇게하려면 ~ 50ml 멸균 수돗물에 5 분 및 resuspend을 위해 3000 RPM의 계란을 원심 분리기. 유리 슬라이드 50 μl 계란과 장소를 제거합니다. 40x 배율을 사용하면 50 μl에 가능한 embryonated 달걀의 개수를 계산합니다. 50 μl 50 가능한 알을주고 달걀을 희석. 가능한 계란의 이미지에 대한 Kopper와 맨스필드 16 연구를 참조하시기 바랍니다.
2. Trichuris muris 달걀 (200 알 / 마우스)의 실험 생쥐의 급성 감염
- 철저하게 resuspend 계란은 생쥐의 수를 치료 정도로 볼륨을 제거 X 2 (예 : 10 쥐 200 μl x를 받아 10 쥐 X 2 = 4 알을 MLS)와 14 ML 스냅 캡 튜브에서 그들을 놓으십시오.
- 섞어 14 ML 스냅 캡 튜브를 반전. 적절한 크기의 먹이를 바늘 1 ML 주사기 (우리는 18 게이지 1 1 / 2 "바늘을 사용 25g 무게 쥐)에 계란 200 μl를 가져와. 한손으로 아저씨에서 마우스와 다른 손을 사용은 경구 gavage으로 달걀을 관리 .
- 21일 만요.
3. 실험 수확
- 일 21 CO 2를 사용하여 쥐를 희생.
- 심장 관통하여 생쥐에서 혈액을 수집이 아닌 heparinized 주사기에 4에서 저장 ° C. 그 다음날은 -20 ° C.에서 혈청 및 동결을 분리 혈청은 엘리사에 의해 Trichuris 특정 IgGs 및 IGE의 검출에 사용될 수 있습니다.
- 마우스의 복부 측면을 폭로하고 70 %의 에탄올과 함께 복부가 젖었어.
- 사용 포셉은 복부 피부를 파악하고 가위를 사용하여 작은 절개를합니다. 피부 및 복부 내용을 폭로 기본 멤브레인 컷.
- 소장, 맹장 및 결장을 확인합니다. 포셉과 맹장를 잡고 복강 밖으로 당기십시오. 포셉 또 한 쌍의와 mesenteric 림프절 (mLNs)를 노출 오른쪽으로 작은 창자를 밀어. 미디어 2 MLS를 포함한 15 ML 팔콘의 내장과 장소로 절단되지 않도록주의되는 mLNs를 제거합니다. 원하는 경우 이러한 엘리사와 세포내 F로 시토킨 분석 72 시간을위한 처리 및 체외 (1 μg / ML αCD3/CD28 또는 50μg/ml 4h Trichuris 자세 24 잘 접시 1 ML에 4x10 6 / ML)에서 restimulated 수 있습니다낮은 cytometry.
- 이게 맹장과 결장을 잘라 버릴거야.
- 포셉을 사용하여 2 ML Axygen 튜브의 말초 콜론과 장소에서 배설물로 알약을 밖으로 밀어. -20 ° C.에 프리즈 방패 알약은 분자 β (RELM - β) resistin와 같은 표현을위한 서양 얼룩으로 분석하실 수 있습니다.
- 이게 맹장 (~ 0.5 cm)의 끝부분을 제거합니다. 배설물이 집게와 맹장의 끝부분을 잡고 제거하고 PBS는 배양 접시에있는 3 ML의 주사기와 22 게이지 바늘을 사용하여 함께 플러시하려면 다음과 같이하십시오. 5 ML 팰컨 스냅 캡 튜브에 신선한 4 % paraformaldehyde에 놓습니다. 4 스토어 ° C. 이들은 파라핀 - 임베디드, sectioned 및 histological 분석을위한 슬라이드에 장착할 수 있습니다.
- RNA에 대한 근위 대장 (~ 1cm)의 조각을 제거합니다. 500 μl RNAlater 2 ML Axygen 튜브에 샘플을 넣어. 4 스토어 ° C. 이 샘플은 qPCR에 의해 mRNA의 표현에 대해 분석하실 수 있습니다.
- -20 ° C.에 표시 페트리 접시와 동결에이게 맹장의 나머지 부분을 플레이스
4. 이게 맹장에서 Trichuris muris 벌레의 열거
- ~ 5 ML 물이 들어있는 배양 접시에있는 냉장고와 장소에서이게 맹장을 제거합니다.
- 가위를 사용하여 루멘을 폭로이게 맹장을 잘라 냈어.
- 포셉과 맹장을 보유하고 적극적으로 대변의 대부분을 제거하는 맹장를 흔들.
- 물을 포함하고 부드럽게 IECs에게 기본 조직을 긁어 부드러운 곡선 집게를 사용하여 다른 배양 접시에이게 맹장을 전송.
- 물을 포함하는 새로운 배양 접시에이게 맹장을 전송하고 적극적으로 작은 조각으로 조직을 추출, 집게로 남아있는 조직을 다쳤어요.
- 배양 접시의 모든 3에있는 벌레의 모든 통계를 해부 현미경을 사용합니다. 당신이 벌레 같은 벌레를 위해 접시에서 제거 찾아서 두 번 계산되지 않습니다. 웜이 손상된 경우 (예 : 반으로 깨진) 정확한 숫자는 파악에만 두꺼운 또는 얇은 끝이 계산합니다.
5. 대표 결과
Trichuris muris 감염 모델 연구가 기생충이 부담하고 체계적인 면역 반응뿐만 아니라, histologically 검사 말초이게 맹장 내의 염증 반응을 계량 할 수 있습니다. 수확이게 맹장의 루멘가 노출되면, Trichuris 벌레는 해부 현미경 (그림 1A - B)를 사용하여 열거 수 있습니다. Trichuris에 면책의 매개 변수는 항체 모성 동물 IgG1로 전환 isotype (Th2 타입 면역과 관련된), 그리고 민감한 동물 IgG2a (Th1 타입의 면역과 관련된) (그림 1C)을 포함합니다. 잔 세포 특정 단백질 resistin 같은 분자 β (RELM - β)의 표현은 Trichuris의 통관과 관련된과 서양 얼룩 분석 (그림 2)에 의해 감지입니다. 이게 맹장의 말초 부분은 고블렛 셀 반응 및 감염에 대한 응답으로 장의 염증의 범위 (그림 3)을 평가하기 위해주기적인 산성 - 쉬프 (PAS) 물들일 수 있습니다.
그림 1. Trichuris muris에 면책의 부량. (A) 저항 (B6) 쥐가 하루 21 이후의 감염에 의해 Trichuris의 muris을 추방. 반대로, 민감한 (AKR / J) 생쥐는 만성 기생충 설립에 결과 Trichuris에 감염된다. 각 막대는 평균 ± 그룹당 4-8의 SEM 동물을 나타냅니다. (B) 웜은 해부 현미경을 사용하여 계산됩니다. 톱 패널 격리 벌레를 보여줍니다, 하단 패널은 IECs과 대소변의 존재에 벌레를 보여줍니다. (C) Trichuris 특정 IgG2a의 titres는 배설 Trichuris의 항원 (O / N 자세, 5 μg / 코팅 접시에 희석 혈청 엘리사 (1시 2분 희석, 희석 1시 20분에서 시작하고 1:2560에 종료)에 의해 결정됩니다 ML). 민감한 AKR / J 마우스는 모성 B6 생쥐보다 Trichuris 특정 혈청 IgG2a의 특히 높은 수준의 수 있습니다.
그림 2. Trichuris muris의 통관은 잔 세포 특정 단백질 RELM - β 7 표현과 연결됩니다. RELM - β 생산 Trichuris - 감염 방지 (B6)에서 배설물 여럿 발견하지만, 서양 얼룩 분석하여 쥐 (AKR / J) 감염될 수는 없습니다. 각 레인, (N) = 나이브 (TM) = 21 일 Trichuris 감염된 쥐 한 동물의 대표입니다.
그림 3. 말초이게 맹장 다음 Trichuris 감염의 Histological 시험. 말초이게 맹장의 5-7 μm의 섹션은 PAS 물들다. 고블렛 셀 증식 및 점액 생산 방지 (B6)에서 분명하지만, Trichuris 감염 다음 쥐 (AKR / J) 취약하지 않습니다.
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Discussion
이 프로토콜은 자세한 조사가 필요에 따라 수정할 수있는 표준 고용량 급성 Trichuris muris 감염합니다. 예를 들어, 마우스가 희생될 수 있으며, 조직은 다른 일 수확. 생쥐가 성공적으로 가득 벌레 부담을 설립한다는 결정하기 위해 그들은 모두 쥐가 약 200 벌레의 부담을 가지고해야하는 시점에서, 하루 14 희생하실 수 있습니다. 생쥐도 감지하는 웜이 성숙에 도달하고 그 삶의 기간 동안 호스트와 남아 것이 32일에 대한 감염 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 만성 Trichuris muris 감염을 모델로 적용할 수 있습니다. 이렇게하려면 관리 계란 선량은 저용량 감염 (약 30 알)을 조정할 수 있습니다. 이 약을에서 정상적으로 모성 마우스는 보호 Th2 반응을 유도하지 않는 것이 아니라 Th1 반응을 생성하고 약 20 웜 17 부담을 유지합니다.
다른 감염 모델을 통해 Trichuris muris 감염 모델 중 하나 장점은 일반적으로 감염된 쥐가 어떤 병적 상태이나 사망률을 전시하지 않는 것이있다. 연구자들은 인식해야한다는 실험 결과에 영향을 미칠 수있는 요인은 그러나이 있습니다. 첫 번째 요소는 생쥐의 배경 변형입니다. 으로 검색 결과에 명시된, C57BL / 6 마우스가 저항하고 AKR / J 쥐가 마찬가지로, 민감한, 그리고 다른 근친 계통은 다른 감염 프로필있을 수 있습니다. 따라서 연구자들은 생쥐의 배경 변형 인식하고 적절한 컨트롤 마우스를 사용하는 것이 중요합니다. 우려에 대한 필요 일부 정상적으로 저항 제어 마우스 21 일 게시물 감염에서 30 웜을해야하는 경우가 없습니다 그래서 또한, 기생충 통관에 마우스 투 마우스 변동있을 수 있습니다. 뿐만 아니라, 민감한 마우스는 항상 전체 200 카운트 웜 부담을 유지하지 않겠지만이게 맹장 약 75-200 웜에서 범위 수 있습니다. 이 변화는 또한 다른 시설에 보관되어 생쥐의 용기를 식물의 자연 변동에 의해 설명할 수 있습니다.
부정 Trichuris muris 감염에 영향을 미치는 요소는 pinworm의 존재입니다. Pinworms는 Trichuris 같은 해부 사이트를 감염하고 Trichuris 연구의 해석을 배가시켜 야지 수있는 면역 반응을 유도. 또한, pinworm 치료 (albendazole, fenbendazole)도 Trichuris를 죽이기. 이 실험 절차, 우리는 특정 - 병원체 무료 조건에서 유지됩니다 마우스를 사용하고, 그것은 실험 생쥐가 이전 Trichuris muris 감염과 중 pinworm 무료로 유지하는 것이 최우선이다.
일부 사소한 포인트 연구자들은 알고 있어야 :
- 계란은 물 PBS 유지되어야합니다.
- 계란은 매우 무거운 있으며 따라서 각 마우스 배달하기 전에 resuspended해야합니다. 또한, 그들은 주사기에 정착하므로, 한 번에 하나의 마우스를 감염 달걀만을 충분한 볼륨을로드합니다.
- 일부 희귀 변종은 감염의 성 차이를 보여주지만, 대부분의 경우, 남성 또는 여성 중 하나는 Trichuris muris 감염에 사용할 수 있습니다.
- 이 모델과 감염의 수평 이동에 대한 우려가 없습니다 나이브로 생쥐는 감염된 생쥐로 같은 감방에 지내게 될 수 있습니다.
전체 Trichuris muris 감염은 Th2 모델 종속적인 면역을 수행하는 간단한 절차입니다 그리고 개인 연구자의 요구에 맞게 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
동물 실험은 브리티시 컬럼비아 대학교에서 정한 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 (MSH - 95368, 청소 - 89,773 및 CZ하는 걸레 - 106623)과 혁신에 대한 캐나다 재단에 의해 지원되었다. SCM은 위장 박사 교제의 CIHR / 캐나다 협회의받는 사람입니다. CZ는 CIHR 새로운 탐정이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles (18 x 1½") | Popper & Sons, Inc. | 7912 | |
| Smooth curved Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5047 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | Jackson Laboratory | 005557 | These are the mice we used, however, any immunodeficient mice or susceptible strain should work. |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | |
| 2 ml tubes | Axygen Scientific | MCT-200-C | |
| 15 ml tubes | Falcon BD | 352096 | |
| 6 well plates | Falcon BD | 353046 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-RELMβ antibody | PeproTech Inc | 0694270Rb |
References
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