Summary
鞭muris感染肠道模型是一种Th2型免疫抗小鼠Th2反应产生保护和易感小鼠产生一种病态的Th1反应。
Abstract
鞭muris是一个自然的小鼠的病原体和鞭虫物种感染人类和牲畜 1的生物学和抗原性相似。感染性虫卵经口灌胃，在远端小肠孵化，侵入肠上皮细胞（IECS），该行盲肠和近端结肠隐窝和成熟后的蠕虫释放到环境中的鸡蛋1。这个模型是一个功能强大的工具来检查因素控制的CD4 +辅助性T细胞（TH）的激活，以及在肠上皮细胞的变化。免疫反应的抗近交系C57BL / 6和BALB / C，如发生的特点，是由Th2细胞极化的细胞因子（IL - 4，IL - 5和IL - 13）和驱逐的蠕虫病毒，而Th1相关的细胞因子（IL -12，IL - 18，IFN -γ）促进在遗传易感性的AKR / J 小鼠 2-6的慢性感染。 Th2细胞因子，促进生理肠道微环境的变化，包括IECS的快速周转，杯状细胞的分化，招聘和上皮通透性和平滑肌收缩，所有这一切都已经在蠕虫驱逐7-15牵连的变化。在这里，我们详细为传播鞭muris可以在随后的实验中使用的鸡蛋的的协议。我们还提供了为感染后的分析建议的样品实验收获。总体而言，该协议将提供的基本工具的研究人员，执行鞭muris小鼠感染模型，它可以用来解决有关的问题在胃肠道以及免疫效应功能的IECS钍倾向。
Protocol
1。传播鞭muris蛋
- 要生成新的批次的鞭muris蛋，感染20-30免疫缺陷小鼠（如NOD.Cg Prkdc SCID IL2RG tm1Wjl / SZJ（NSG）或129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa（RAG2 - / - ））或遗传易感性小鼠（如AKR / J）6-8周约300鞭灌胃muris鸡蛋。
- CO 2窒息牺牲后32-35天的小鼠。
- 揭露鼠标的腹侧方和湿用70％乙醇的腹部。
- 使用镊子把握腹部皮肤，使一个小切口，用剪刀。切开皮肤暴露在腹腔内容。
- 确定盲肠和大肠近端，并删除它们。
- 放置在一个10厘米的培养皿贝科改良Eagle培养基（DMEM）含500 U / ml青霉素和500微克/毫升链霉素（P / S）的菜的盲肠和大肠近端。切盲肠公开揭露管腔和蠕虫。使用钳地方盲肠在一个烧杯中的磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻摇动，以除去粪便。
- 返回盲肠培养皿和使用顺利弯钳（Roboz RS - 5047），轻轻拔出蠕虫和6以及含有5毫升的DMEM + P / S板以及
- 重复此过程为所有的老鼠。
- 特百惠容器用湿纸巾保持孵育湿度在37 ° C时4小时，6孔板。
- 4小时后删除蠕虫使用光滑的弯钳，他们分成2新井的6孔板含5毫升的DMEM + P / S收获在15毫升猎鹰管原作的内容和地点。转速3000 RPM，并删除和储备上清管4小时抗原（可用于细胞restimulation后用PBS透析，典型的蛋白产量是10-20毫克每20只小鼠）和重悬卵灭菌自来水中含有颗粒。
- 将6孔板，37℃过夜。移走的蠕虫。收获成猎鹰管，并在5分钟3000转的旋转井的内容。一夜之间抗原（可用于鞭银的特定抗体的同型酶联免疫吸附后用PBS透析，典型的蛋白产量是10-20毫克每20只小鼠）和重悬卵含在灭菌自来水沉淀取出上清液和储备。
- 结合4小时和隔夜的鸡蛋和鸡蛋通过70μm滤网过滤，以消除任何剩余的蠕虫病毒，然后转移到75厘米的2烧瓶。保持在一个黑暗的地方所涵盖的6个星期在室温（RT）在铝箔的烧瓶。
- 蒸压自来水洗净的鸡蛋和50可行的鸡蛋在50μL重悬。要做到这一点，离心5分钟〜50毫升无菌自来水悬浮在3000 RPM的鸡蛋。在玻片上，取出50μL鸡蛋和地点。使用40倍的放大倍率数在50μL可行的鸡胚。稀释50μL给50个可行的鸡蛋的蛋。对于可行鸡蛋的图像，请参阅研究科珀菲尔德16。
2。 鞭muris蛋（200粒卵/鼠标）的实验小鼠的急性感染
- 彻底悬浮鸡蛋和删除足够的量来治疗小鼠的数量× 2（如10只小鼠，取200μLx 10只× 2 = 4鸡蛋MLS），并放置在一个14毫升的管理单元帽筒。
- 反转14毫升的管理单元帽筒组合。到一个适当大小的喂养针1毫升注射器（小鼠重25克，我们用18号1 1 / 2“针）200μL的鸡蛋，一方面颈背鼠标和使用，另一方面管理灌胃鸡蛋。
- 等待21天。
3。实验收获
- 第21天牺牲小鼠使用的CO 2。
- 从小鼠心脏穿刺收集血液，在非肝素的注射器，并储存在4 ° C翌日，分离血清于-20 ° C和冻结血清可用于鞭特定的IgG和IgE的检测采用ELISA法。
- 揭露鼠标的腹侧方和湿用70％乙醇的腹部。
- 使用镊子把握腹部皮肤，使一个小切口，用剪刀。切开皮肤和底层膜暴露腹腔内容。
- 确定小肠，盲肠和结肠。抓住盲肠与钳拉腹腔。用另一双钳推到正确的暴露肠系膜淋巴结（mLNs）小肠。删除mLNs小心，不要削减进入肠道，并在15毫升含2 MLS的媒体猎鹰。如果需要，这些都可以处理，并在体外细胞因子的分析为72小时（4 × 6 /毫升在1微克/毫升αCD3/CD28或50μg/ml4H鞭银在24孔板的1毫升）restimulated ELISA和细胞内f低流式细胞仪。
- 切盲肠和结肠。
- 使用镊子，推动从远端结肠和地方在2毫升爱思进管粪粒。冻结在-20 ° C。粪粒，可抵抗分子β（RELM -β）表达的免疫印迹分析。
- 取出盲肠（约0.5厘米）的提示。要删除，粪便举行钳盲肠提示和冲洗，用PBS在培养皿中使用3毫升的注射器和22号针头。在新鲜的4％多聚甲醛5毫升猎鹰捕捉帽筒的地方。保存在4 ° C。这些都可以石蜡包埋，切片和组织学分析的幻灯片上。
- 取下一块的RNA（〜1厘米）的近端结肠。用500μlRNAlater样品放入2毫升爱思进管。保存在4 ° C。这些样品可通过定量PCR分析mRNA表达。
- 放置于-20 ° C在一个标签的培养皿中，并冻结其余的盲肠
4。在盲肠鞭muris蠕虫枚举
- 从冰箱放置在培养皿〜5毫升的水盘取出盲肠。
- 用剪刀剖开盲肠暴露管腔。
- 与钳举行的盲肠和大力摇晃盲肠删除大部分粪便。
- 盲肠转移到另一个培养皿中含有水和使用光滑的弯钳轻轻刮去IECS的根本组织。
- 盲肠转移到一个新的培养皿中含有水，并积极与钳刮余下的组织，翻录成小块的组织。
- 使用解剖显微镜计数所有的蠕虫在所有的培养皿3。正如你发现一种蠕虫病毒删除从盘，以确保相同的蠕虫，不计两次。如果蠕虫被损坏（即一半打破）只计算厚或薄的两端，以获得准确计数。
5。代表性的成果
鞭muris感染模型使研究人员能够量化寄生虫负担和全身免疫反应，以及病理检查远端盲肠内的炎症反应。当收获盲肠腔暴露出来， 鞭虫蠕虫可以枚举使用解剖显微镜（图1A - B）。 鞭免疫力参数，还包括抗动物抗体亚型，切换到IgG1的（与Th2型免疫相关），和IgG2a易感动物（与Th1型免疫相关）（图1C ）。杯状细胞特异性蛋白抵抗分子β（RELM -β）的表达与鞭间隙和Western blot分析（图2）检测。盲肠末端的部分，可以与碘酸雪夫（PAS）染色评估杯状细胞的反应和对感染的反应程度的肠道炎症（图3）。
图1。量化的免疫力鞭muris。 （一）抗（B6）小鼠驱逐鞭muris感染后第21天。相比之下，成为慢性感染易感（AKR / J）小鼠与鞭虫 ，导致寄生虫建立。每个条形代表的平均± SEM 4-8动物每组。 （二）蠕虫是使用解剖显微镜计数。顶板显示在隔离蠕虫，底部面板显示蠕虫IECS和粪便的存在。 （三） 鞭特定的IgG2a抗体滴度排泄鞭抗原（O / N银，5微克/涂层钢板是由稀释血清的ELISA（1:2稀释，在1:20稀释开始和结束在1:2560）毫升）。易感AKR / J小鼠鞭特异性血清IgG2a水平较高，特别是较耐B6小鼠。
图2。 鞭muris间隙与杯状RELM -β细胞特异性蛋白7表达 。 RELM -β的生产，可以检测到从鞭虫感染的耐药（B6）的粪粒，但不容易（AKR / J）小鼠免疫印迹分析。每个通道是代表一个单一的动物，（N）=天真，（TM）= 21天鞭虫感染小鼠。
图3。远端盲肠以下鞭虫感染的病理组织学检查。 5-7微米的远端盲肠段与保安局首席助理局长染色。杯状细胞增生和粘液生产明显耐药（B6），但不容易（AKR / J） 小鼠，鞭虫感染。
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Discussion
该协议的细节了一个标准的高剂量急性鞭muris感染研究者的要求，可以修改。例如，老鼠可以牺牲和组织在不同的日子里收获。要确定小鼠已成功建立了完整的蠕虫负担，他们可以被牺牲的第14天，在这一点所有小鼠，应随身携带了约200蠕虫的负担。也可被感染小鼠的32天检测到任何蠕虫将达到成熟阶段，并会维持其生命期限的主机。此外，该协议可以适应慢性鞭虫muris感染模型。要做到这一点，管理的鸡蛋剂量可以调整，以低剂量感染（约30鸡蛋）。在这一剂量时，通常是耐药的小鼠不能诱导保护的Th2反应，而是产生Th1反应和维持一个负担约 20蠕虫17。
鞭muris对其他感染模型的感染模式的一个好处是，一般情况下感染小鼠没有表现出任何发病率或死亡率。然而，有因素会影响实验结果，研究人员应该知道。第一个因素是背景的小鼠株。结果概述，C57BL / 6小鼠抵抗和AKR / J小鼠容易，同样，其他近交系可能有不同的的感染型材。因此重要的是，研究人员知道他们的小鼠的背景株，并使用适当的对照组小鼠。此外，可以有鼠标，鼠标在寄生虫间隙的变化，所以不存在需要关注，如果一些通常性对照组小鼠在感染后21天到30蠕虫。同时，易感小鼠不会始终保持一个完整的200计数蠕虫负担，但可以范围从大约75％至200％，盲肠蠕虫。这种变化也可以由安置在不同的设施小鼠的肠道菌群的自然变化。
一个因素产生不利影响鞭muris感染蛲虫的存在。蛲虫感染鞭相同的解剖部位和诱发免疫反应，可以混淆鞭研究的解释。此外，蛲虫治疗（阿苯达唑，芬苯达唑）也杀死鞭 。在这个实验过程中，我们使用小鼠特定病原体免费条件下保持，至关重要的是，实验小鼠蛲虫感染鞭 muris之前和期间免费存放。
一些次要的研究人员应该知道的：
- 鸡蛋应保持在水，不PBS。
- 鸡蛋是非常沉重的，因此，应先交付给每个鼠标悬浮。此外，负载只感染一次鼠标的鸡蛋足够的量，因为他们将在注射器中解决。
- 一些罕见的菌株显示在传染性的性别差异，但在大多数情况下，无论是男性或女性， 可用于鞭虫muris感染。
- 朴素的老鼠可以被安置在感染小鼠同笼，有没有感染的横向转移，这种模式的关注。
总的来说， 鞭虫muris感染是一个简单的程序来执行的模型TH2依赖免疫的，可以调整，以适应个别研究人员的需求。
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Disclosures
动物实验是由加拿大英属哥伦比亚大学提出的准则和法规的规定执行。
Acknowledgments
这项工作是支持的加拿大卫生研究院（MSH - 95368，澳门币89773和MOP - 106623，以锆石）和加拿大创新基金会。 SCM是一个胃肠病学博士后CIHR /加拿大协会的收件人。锆石是一种新CIHR调查。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles (18 x 1½") | Popper & Sons, Inc. | 7912 | |
| Smooth curved Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5047 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | Jackson Laboratory | 005557 | These are the mice we used, however, any immunodeficient mice or susceptible strain should work. |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | |
| 2 ml tubes | Axygen Scientific | MCT-200-C | |
| 15 ml tubes | Falcon BD | 352096 | |
| 6 well plates | Falcon BD | 353046 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-RELMβ antibody | PeproTech Inc | 0694270Rb |
References
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