Summary
Trichuris muris Infektion ist ein Darm-Modell von Th2 Immunität, wo resistente Mäuse generieren eine schützende Th2-Antwort und anfälligen Mäusen erzeugen eine pathologische Th1-Antwort.
Abstract
Trichuris muris ist eine natürliche Erreger von Mäusen und ist biologisch und antigenetisch ähnlich Spezies Trichuris, dass Mensch und Tier 1 zu infizieren. Infektiöse Eier durch orale Gabe, schlüpfen in die distalen Dünndarm gegeben sind, dringen in die Darmepithelzellen (IECs), die Linie der Krypten des Blinddarms und proximalen Kolon und bei der Reifung der Würmer Eier Freisetzung in die Umwelt 1. Dieses Modell ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Faktoren zu prüfen, dass die Kontrolle CD4 + T-Helferzellen (Th)-Zell-Aktivierung sowie Änderungen im Darmepithel. Die Immunantwort, die in resistenten Inzuchtstämme, wie C57BL / 6 und BALB / c auftritt, wird von Th2 polarisiert Zytokine (IL-4, IL-5 und IL-13) und Vertreibung von Würmern während Th1-assoziierte Zytokine (IL charakterisiert -12, IL-18, IFN-γ) zu fördern chronische Infektionen bei genetisch anfälligen AKR / J-Mäuse 2-6. Th2-Zytokine fördern physiologische Veränderungen in der Darm-Mikroumgebung einschließlich schnellen Umsatz von IECs, Pokal-Zell-Differenzierung, Rekrutierung und Veränderungen in epithelialen Permeabilität und Kontraktion der glatten Muskulatur, die alle in Wurm Vertreibung 7-15 verwickelt waren. Hier haben wir ausführlich ein Protokoll für die Verbreitung Trichuris muris Eier, die in nachfolgenden Experimenten verwendet werden können. Wir bieten auch eine Probe experimentelle Ernte mit Vorschlägen für post-Infektion Analyse. Insgesamt wird dieses Protokoll Forscher mit den grundlegenden Tools, um eine Trichuris muris Maus Infektion Modell, das verwendet werden, um Fragen zu Th Neigung in den Magen-Darm-Trakt sowie Immun-Effektor-Funktionen von IECs Adresse kann wahrnehmen können.
Protocol
1. Propagierung von Trichuris muris Eier
- So generieren Sie neue Chargen von Trichuris muris Eier, infizieren 20-30 immundefizienten Mäusen (zB NOD.Cg-Prkdc scid IL2RG tm1Wjl / SzJ (NSG) oder 129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa (RAG2 - / -)) oder genetisch anfälligen Mäusen ( zB. AKR / J), die 6-8 Wochen alt, mit ca. 300 Trichuris muris Eier durch orale Gabe sind.
- Nach 32-35 Tage opfern die Mäuse durch CO 2-Erstickung.
- Expose der Bauchseite der Maus und nassen Bauch mit 70% Ethanol.
- Mit einer Pinzette fassen die Bauchhaut und machen einen kleinen Schnitt mit einer Schere. Schneiden Sie die Haut an den Bauch-Inhalte setzen.
- Identifizieren des Blinddarms und des proximalen Dickdarms, und entfernen Sie sie.
- Setzen Sie den Blinddarm und proximalen Dickdarm in einer 10 cm Petrischale mit Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) mit 500 U / ml Penicillin und 500 ug / ml Streptomycin (P / S). Schneiden Sie den Blinddarm öffnen, um das Lumen und die Würmer ausgesetzt. Mit einer Pinzette Ort Blinddarm in ein Becherglas mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und leicht schütteln, um Kot zu entfernen.
- Zurück Zökum bis Petrischale mit glatten gebogenen Pinzette (Roboz RS-5047) vorsichtig herausziehen Würmer und legen Sie sie in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 5 ml DMEM + P / S.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Mäuse.
- Legen Sie 6-Well Platte in einer Tupperware-Container mit einem feuchten Papiertuch gegen Feuchtigkeit und bei 37 ° C zu halten für 4 Stunden.
- Nach 4 Stunden entfernen Würmer mit glatten gebogenen Pinzette und teilen Sie sie in 2 neuen Brunnen der 6-Well-Platte mit 5 ml DMEM + P / S. Ernten Sie die Inhalte der ursprünglichen gut und in einem 15 ml Falcon-Röhrchen. Spin Röhrchen bei 3000 rpm und entfernen und behalten Überstand als 4 Std. Antigen (kann für die Zell-Restimulation nach PBS Dialyse, wo typische Protein Renditen sind 10-20 mg pro 20 Mäusen verwendet werden) und resuspendieren Ei-haltige Pellet in autoklaviert Leitungswasser.
- Legen Sie die 6-Well-Platte wieder bei 37 ° C über Nacht. Entfernen und Entsorgen der Würmer. Ernten Sie die Inhalte der Brunnen in ein Falcon-Röhrchen und drehen mit 3000 rpm für 5 min. Überstand entfernen und behalten so über Nacht Antigen (für Trichuris Ag spezifischen Antikörper-Isotyp ELISAs nach PBS Dialyse, wo typische Protein Renditen sind 10-20 mg pro 20 Mäusen verwendet werden) und resuspendieren Ei-haltige Pellet in autoklaviert Leitungswasser.
- Kombinieren Sie 4 Stunden und über Nacht Eier und filtern Sie die Eier durch die 70μm Sieb übrig gebliebene Würmer entfernen Sie dann in eine 75 cm 2-Kolben übertragen. Halten Sie Flasche an einem dunklen Ort in Folie für 6 Wochen abgedeckt bei Raumtemperatur (RT).
- Wash Eier in autoklaviert Leitungswasser und resuspendieren bei 50 lebensfähige Eier in 50 ul. Um dies zu tun, Zentrifuge Eier bei 3000 rpm für 5 min und Resuspendieren in ~ 50ml sterile Leitungswasser. Entfernen 50 pl Eier und auf ein Glasplättchen. Mit dem 40-facher Vergrößerung zählen die Anzahl der lebensfähigen embryonierten Eier in den 50 pl. Verdünnen Sie Eier zu 50 lebensfähige Eier in 50 ul geben. Für Bilder von lebensfähigen Eier finden Sie in der Studie von Kopper und Mansfield 16.
2. Akute Infektionen der experimentellen Mäuse mit Trichuris muris Eier (200 Eier / Maus)
- Gründlich resuspendieren Eier und entfernen Sie genügend Volumen, um die Anzahl der Mäuse zu behandeln X 2 (zB für 10 Mäuse nehmen 200 ul x 10 Mäusen x 2 = 4 ml Eier) und legen Sie sie in eine 14 ml Schnappdeckel Röhre.
- Kehren Sie die 14 ml Schnappdeckel Rohr zu mischen. Rufen Sie 200 ul von Eiern in 1 ml Spritze auf eine geeignete Größe Fütterung Nadel (für Mäuse mit einem Gewicht 25 Gramm wir benutzten dazu 18 Spur 1 1 / 2 "Nadeln). In der einen Hand scruff der Maus und mit der anderen Hand verwalten Eier durch orale Gabe .
- Warten Sie 21 Tage.
3. Experimentelle Ernte
- Am Tag 21 Opfer die Mäuse mit CO 2.
- Entnehmen Sie das Blut von Mäusen durch Herzpunktion, in einem nicht-heparinisierten Spritze, und lagern bei 4 ° C. Am nächsten Tag isolieren Serum und bei -20 ° C. Serum kann für den Nachweis von Trichuris-spezifischen IgG und IgE durch ELISA verwendet werden.
- Expose der Bauchseite der Maus und nassen Bauch mit 70% Ethanol.
- Mit einer Pinzette fassen die Bauchhaut und machen einen kleinen Schnitt mit einer Schere. Schneiden Sie die Haut und des darunterliegenden Membran auf die Bauch-Inhalte setzen.
- Identifizieren Sie die Dünndarm, Blinddarm und Dickdarm. Besorgen Sie sich die Blinddarm mit einer Pinzette und ziehen Sie aus der Bauchhöhle. Mit anderen Pinzette push Dünndarm nach rechts Freilegung der mesenterialen Lymphknoten (MLNs). Entfernen Sie die MLNs man aufpassen, nicht in den Darm und in ein 15 ml Falcon mit 2 ml Medium geschnitten. Auf Wunsch können diese bearbeitet und restimuliert in vitro (4x10 6 / ml in 1 ml in 24-Well-Platten mit 1 pg / ml αCD3/CD28 oder mit 50μg/ml 4h Trichuris Ag) für 72 Stunden für Zytokin-Analyse durch ELISA und intrazellulären fLow-Zytometrie.
- Schneiden Sie den Blinddarm und Dickdarm.
- Mit einer Pinzette, Push-out fäkalen Pellets aus distalen Kolon und in ein 2 ml Axygen Röhre. Einfrieren bei -20 ° C. Fecal Pellets kann durch Western-Blot die Expression von Resistin-ähnlichen Molekül-β (RELM-β) analysiert werden.
- Entfernen Sie die Spitze des Blinddarms (~ 0,5 cm). So entfernen Sie Kot halten Blinddarm Spitze mit einer Pinzette und bündig mit PBS unter Verwendung einer 3-ml-Spritze und 22-Gauge-Nadel in eine Petrischale. Legen Sie in frischen 4% Paraformaldehyd in 5 ml Falcon Schnappdeckel Röhre. Lagerung bei 4 ° C. Diese können in Paraffin eingebettet, geschnitten und montiert auf Folien für die histologische Analyse.
- Nehmen Sie ein Stück proximalen Kolon (~ 1 cm) für RNA. Put Probe in 2 ml Axygen Rohr mit 500 ul RNAlater. Lagerung bei 4 ° C. Diese Proben können mRNA-Expression von qPCR analysiert werden.
- Platzieren Sie den Rest des Blinddarms in einem markierten Petrischale und bei -20 ° C.
4. Enumeration von Trichuris muris Würmer im Blinddarm
- Entfernen Blinddarm aus dem Gefrierschrank und in einer Petrischale mit ca. 5 ml Wasser.
- Mit Schere, aufgeschnitten Blinddarm mit dem Lumen aussetzen.
- Halten Sie den Blinddarm mit einer Pinzette und kräftig schütteln den Blinddarm, die Mehrheit der Kot zu entfernen.
- Transfer Blinddarm zu einem anderen Petrischale mit Wasser und mit glatten gebogenen Pinzette vorsichtig abkratzen IECs das darunter liegende Gewebe.
- Transfer-Blinddarm, um eine neue Petrischale mit Wasser und kräftig kratzen verbleibende Gewebe mit der Pinzette, riss das Gewebe in kleine Stücke.
- Verwenden Sie ein Binokular, um alle die Würmer in allen 3 der Petrischalen zählen. Wie finden Sie einen Wurm entfernen Sie sie aus der Schüssel auf den gleichen Wurm sicher nicht doppelt gezählt. Wenn Würmer beschädigt sind (dh in zwei Hälften zerbrochen) zählen nur dick oder dünn Enden an eine genaue Anzahl zu bekommen.
5. Repräsentative Ergebnisse
Die Trichuris muris Infektion Modell ermöglicht es Forschern, Parasitenbelastung und systemische Immunantwort, sowie histologisch untersuchen die entzündliche Reaktion in den distalen Blinddarm zu quantifizieren. Wenn das Lumen des geernteten Blinddarm ausgesetzt ist, kann Trichuris Würmer aufgezählt mit einem Binokular (Abbildung 1A-B) sein. Parameter der Immunität gegen Trichuris auch Antikörperisotyp Wechsel zu IgG1 (verbunden mit Th2-Typ Immunität) in resistenten Tieren und IgG2a (assoziiert mit Th1-Typ Immunität) in empfänglichen Tieren (Abbildung 1C). Expression des Becherzelle-spezifisches Protein Resistin-ähnlichen Molekül-β (RELM-β) ist mit Abstand der Trichuris assoziiert und ist nachweisbar durch Western-Blot-Analyse (Abbildung 2). Der distale Teil des Blinddarms kann mit Periodic Acid-Schiff (PAS) gefärbt werden, um Pokal-Zell-Reaktionen und das Ausmaß der Darmentzündung in Reaktion auf eine Infektion (Abbildung 3) zu beurteilen.
Abbildung 1. Die Quantifizierung der Immunität gegen Trichuris muris. (A) Resistant (B6) Mäuse vertreiben Trichuris muris bis Tag 21 nach der Infektion. Im Gegensatz dazu werden anfällig (AKR / J) Mäusen chronisch mit Trichuris infiziert, wodurch Parasiten Establishment. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± SEM von 4-8 Tieren pro Gruppe. (B) Worms gezählt mit einem Binokular. Top Panel zeigt Würmer in Isolation, zeigt Bodenplatte Würmer in Gegenwart von IECs und Kot. (C) Trichuris-spezifischen IgG2a Titer mittels ELISA verdünntes Serum (1:2 Verdünnung, beginnend bei 1:20 Verdünnung und endend bei 1:2560) auf Platten mit Ausscheidungsorgane Trichuris Antigen (O / N Ag, 5 ug / beschichtet bestimmt ml). Anfällig AKR / J-Mäuse haben insbesondere höhere Trichuris-spezifischen Serum-IgG2a als resistent B6 Mäusen.
Abbildung 2. Die Clearance von Trichuris muris ist mit der Expression des Becherzelle-spezifisches Protein RELM-β 7 zugeordnet. RELM-β Produktion von fäkalen Pellets aus Trichuris-infizierten resistenten (B6) erfasst werden, nicht aber anfällig (AKR / J) Mäusen durch Western-Blot-Analyse. Jede Spur ist repräsentativ für ein einzelnes Tier, (N) = Naive, (Tm) = 21-Tage-Trichuris infizierten Mäusen.
Abbildung 3. Die histologische Untersuchung des distalen Blinddarm folgenden Trichuris Infektion. 5-7 um Abschnitte des distalen Blinddarm mit PAS gefärbt. Goblet Zell-Hyperplasie und Schleimproduktion sind offensichtlich in resistenten (B6), aber nicht anfällig (AKR / J) Mäusen nach Trichuris Infektion.
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Discussion
Dieses Protokoll Details einer Standard-Hochdosis akuten Trichuris muris Infektion, die modifiziert, wie von dem Prüfer erforderlich werden kann. Zum Beispiel können Mäuse getötet und sein Gewebe an verschiedenen Tagen geerntet. Um festzustellen, dass die Mäuse erfolgreich voller Wurm Belastung etablierten sie sich am Tag 14 geopfert werden, an welcher Stelle alle Mäuse sollte eine Belastung von etwa 200 Würmer tragen. Mäuse können auch für 32 Tage, wo kein Wurm erkannt Reife erreicht haben und würde mit dem Host für die Dauer seines Lebens bleiben infiziert werden. Darüber hinaus kann das Protokoll angepasst an chronischen Trichuris muris Infektion Modell sein. Dazu kann die verabreichte Dosis auf Ei einer niedrigen Dosis Infektion (ca. 30 Eier) eingestellt werden. Bei dieser Dosis nicht normalerweise resistent Mäusen eine schützende Th2-Antwort induzieren, sondern erzeugen eine Th1-Antwort und Pflege einer Belastung von ca. 20 Würmer 17.
Ein Vorteil der Trichuris muris Infektion Modell gegenüber anderen Infektionen Modellen ist, dass im Allgemeinen die infizierten Mäuse zeigen keine Morbidität oder Mortalität. Es gibt jedoch Faktoren, die experimentellen Ergebnisse beeinflussen können, dass die Forscher sollten sich bewusst sein. Der erste Faktor ist der Hintergrund Stamm der Mäuse. Wie in den Ergebnissen dargestellt, C57BL / 6 Mäuse resistent sind und AKR / J-Mäuse sind anfällig, und ebenso können andere Inzuchtstämme haben eine andere Infektion Profile. Deshalb ist es wichtig, dass der Forscher sich der Hintergrund Stamm ihre Mäuse und geeignete Kontroll-Mäusen. Darüber hinaus kann es mit der Maus zu Maus Variation in Parasit-Clearance, so gibt es keinen Grund zur Sorge, wenn einige in der Regel resistent Kontrollmäuse bis zu 30 Würmer in 21 Tage nach der Infektion. Wie gut, wird anfälliger Mäuse nicht immer einen vollen 200-count-Wurm Last, sondern kann von etwa 75 bis 200 Würmer pro Blinddarm-Bereich. Diese Variante kann auch durch natürliche Variation in der Darmflora von Mäusen in verschiedenen Einrichtungen untergebracht berücksichtigt werden.
Ein Faktor, wirkt sich nachteilig auf Trichuris muris Infektion ist das Vorhandensein von Maden. Pinworms infizieren die gleichen anatomischen Stelle als Trichuris und induzieren eine Immunantwort, die die Auslegung des Trichuris Studien verwechseln kann. Darüber hinaus pinworm Behandlung (Albendazol, Fenbendazol) tötet auch Trichuris. In diesem experimentellen Verfahren, verwenden wir Mäuse, die unter bestimmten-Pathogen-freien Bedingungen eingehalten werden, und es ist äußerst wichtig, dass Versuchsmäusen gehalten pinworm frei vor und während Trichuris muris Infektion sein.
Einige kleinere Punkte Forscher bewusst sein sollten:
- Eier sollten in Wasser, nicht PBS beibehalten werden.
- Eier sind sehr schwer und sollte daher vor der Auslieferung an jede Maus resuspendiert werden. Auch Last nur genug Volumen von Eiern zu einem Maus zu einem Zeitpunkt, zu infizieren, da sie in der Spritze zu begleichen.
- Einige seltene Stämme zeigen geschlechtsspezifische Unterschiede in Infektiosität, sondern in den meisten Fällen entweder Männchen oder Weibchen kann für Trichuris muris Infektionen verwendet werden.
- Naive Mäuse können in den gleichen Käfig wie infizierte Mäuse untergebracht werden, da es keine Bedenken von horizontalem Transfer Infektion mit diesem Modell.
Insgesamt ist Trichuris muris Infektion ein einfaches Verfahren, um die Modelle Th2-abhängigen Immunität führen und kann an einzelne Forscher Bedürfnisse angepasst werden.
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Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von The University of British Columbia gesetzt durchgeführt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes of Health Research (MSH-95368, MOP-89773 und MOP-106623 bis CZ) und der Canada Foundation for Innovation unterstützt. SCM ist der Empfänger einer CIHR / Canadian Association of Gastroenterology Postdoc-Stipendium. CZ ist ein CIHR New Investigator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles (18 x 1½") | Popper & Sons, Inc. | 7912 | |
| Smooth curved Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5047 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | Jackson Laboratory | 005557 | These are the mice we used, however, any immunodeficient mice or susceptible strain should work. |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | |
| 2 ml tubes | Axygen Scientific | MCT-200-C | |
| 15 ml tubes | Falcon BD | 352096 | |
| 6 well plates | Falcon BD | 353046 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-RELMβ antibody | PeproTech Inc | 0694270Rb |
References
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