Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Summary

Een robuuste benadering van de levering van organellen monitor aan op de zure lumen van de gist vacuole voor afbraak en recycling wordt beschreven. De methode is gebaseerd op de specifieke etikettering van target organellen met een genetisch gecodeerd dual-emissie fluorescentie pH-biosensor, en visualisatie van individuele cellen met behulp van fluorescentie microscopie.

Abstract

Autofagie belangrijk is voor de omzet van cellulaire componenten onder een waaier van verschillende omstandigheden. Het dient een essentiële homeostatische functie, evenals een kwaliteitscontrole mechanisme dat kan gericht en selectief degraderen cellulair materiaal met inbegrip van organelles1-4. Bijvoorbeeld, beschadigde of overbodige mitochondriën (afb. 1), niet verwijderd door autofagie, kan een bedreiging voor de cellulaire homeostase en overleving van de cel te vertegenwoordigen. In de gist, Saccharomyces cerevisiae, voedingsstoffen deprivatie (bijvoorbeeld stikstof verhongering) of schade kan selectieve omzet van de mitochondria te bevorderen door autofagie in een proces genoemd mitophagy ^5-9.

Beschrijven we een eenvoudige fluorescentie microscopie benadering van autofagie te beoordelen. Voor de duidelijkheid hebben we beperken onze beschrijving hier om te laten zien hoe de aanpak kan worden gebruikt om mitophagy in gistcellen bewaken. De test maakt gebruik van een TL-verslaggever, Rosella, dat is een dual-emissie biosensor bestaat uit een relatief stabiele pH-rood fluorescerend eiwit gekoppeld aan een pH-gevoelige groen fluorescerend eiwit. De werking van deze verslaggever is gebaseerd op de verschillen in pH tussen de vacuole (pH ~ 5,0 tot 5.5) en mitochondriën (pH ~ 8.2) in levende cellen. Onder de groeiomstandigheden, wild-type cellen vertonen zowel de rode en groene fluorescentie verspreid op een manier die kenmerkend is voor de mitochondriën. Fluorescentie-emissie is niet geassocieerd met de vacuole. Wanneer het wordt blootgesteld aan stikstof honger, een aandoening die mitophagy induceert, in aanvulling op rood en groen fluorescentie labelen van de mitochondria, de cellen vertonen de accumulatie van rood, maar niet groene fluorescentie, in de zure vacuolaire lumen die de levering van mitochondriën naar de vacuole. Scoren cellen met rood, maar niet groen fluorescerend vacuolen kan worden gebruikt als een maat voor mitophagic activiteit in cellen ^5,10-12.

Protocol

Het selecteren van geschikte controle giststammen

De test is gebaseerd op de experimentator visuele evaluatie van de accumulatie van rode fluorescentie in de gist vacuole. Als zodanig is de assay is subjectief en afhankelijk van de selectie van geschikte stammen controle-en groei-omstandigheden. Een wilde soort controle wordt gebruikt om de niveaus van autofagie normaal te verwachten aan te geven. Als een negatieve controle een stam null voor de expressie van een van de belangrijkste autofagie genen (bijv. ATG3) is geschikt, deze stammen niet kan leveren materiaal (bijvoorbeeld, mitochondria, nucleus) naar de vacuole

1. Transformatie van gistcellen met plasmide-DNA

Gistcellen kunnen gemakkelijk worden gemaakt bevoegd voor transformatie door behandeling met LiAcetate. Commerciële kits kunnen worden gekocht (bijvoorbeeld EasyComp, Invitrogen) en de gepubliceerde protocollen zijn beschikbaar ^13.

In dit protocol gebruiken we wild-type stam BY4741 (MAT een his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), en enkele leden van een uitgebreide bibliotheek van deletie mutant stammen (bijv. Δ atg3) ontleend, ontbreekt elke uiting van een ander niet-essentiële genen. De verwijdering stam bibliotheek is een waardevol instrument voor het onderzoek van autofagie gebruik van Rosella-gebaseerde probes. De verslaggever die in dit protocol is mt-Rosella voor de mitochondriën (Fig. 2A), gecodeerd door pAS1NB: mt-Rosella ^12.

De volgende stappen zijn gebaseerd op het gebruik van cellen gemaakt met behulp van de bevoegde EasyComp Transformation Kit en bevroren opgeslagen bij -80 ° C voor gemakkelijk gebruik.

1. Equilibreren Solution III (EasyComp Transformation Kit) op kamertemperatuur 30 minuten voor het toevoegen aan gistcellen.
2. Voeg 2 tot 2,5 pl (~ 100 ng / ul) van plasmide DNA dat codeert voor de verslaggever (pAS1NB: mt-Rosella) om een ​​steriele 1,7 ml snap-cap plastic microcentrifugebuis.
3. Voeg 5 ul van vers ontdooide opschorting van de bevoegde gistcellen en meng beide door behoedzame pipetteren.
4. Voeg 50 ul van Solution III (EasyComp Transformation Kit) en vortex te mengen. 1.5) Incubeer de transformatie reacties gedurende 1 uur bij 28-30 ° C met een krachtig mengen elke 15 minuten met behulp van een vortex-mixer of handmatig door flicking de buis met de vinger.
5. Breng voorzichtig de transformatie mengsel tot een YMM agar groeischijf aangevuld met histidine, methionine en uracil, en zachtjes de cellen te verdelen over het oppervlak van de agar met een steriele glazen strooier. Gistcellen zijn kwetsbaar in dit stadium en zachte behandeling kan de opbrengst van de transformanten te verhogen.
6. Incubeer groeischijven voor 2 tot 4 dagen bij 28-30 ° C of totdat kolonies verschijnen ongeveer 2-3 mm in diameter.

2. Bevestiging van de expressie van Rosella in gistcellen

Alvorens gedetailleerde experimenten de juiste lokalisatie en efficiënte werking van de Rosella moet worden bevestigd.

1. Met behulp van steriel tandenstokers te selecteren voor elke stam vijf afzonderlijke kolonies van de transformatie plaat en resuspendeer cellen in 50 ul steriel water in aparte steriele 1,7 ml snap-cap plastic microcentrifugebuis.
2. Plaats 10 pi van elke celsuspensie op aparte label glazen objectglaasjes (76 x 26 mm) en dekking van de celsuspensie met een vierkante dekglaasje (22 x 22 mm).
3. Die onverwijld onderzoekt de cellen voor fluorescentie-emissie met behulp van een fluorescentie microscoop (bijv. Olympus Fluoview FV500). Kijk voor sterke groene en rode fluorescentie en de etikettering van mitochondriaal typische lokalisatie (Fig. 2B en 2C).
4. De rest van elke kolonie onderzocht fluorescentie op deze manier moet worden geënt op een frisse YMM groeischijf.
5. Incubeer de platen bij 28-30 ° C gedurende 2 dagen totdat kolonie zijn ongeveer 2-3 mm in diameter.

3. Celgroei en inductie van autofagie

Autofagie kan worden opgewekt met behulp van een aantal verschillende experimentele condities, inclusief toegang tot stationaire fase, verandering in de koolstofbron, toediening van rapamycine, of stikstof honger. We routinematig gebruik van stikstof honger als de methode om mitophagy induceren.

1. Inoculeren een enkele kolonie in 10 ml groeimedium met ethanol en de juiste auxotrofe supplementen.
2. Incubeer gistculturen bij 28-30 ° C met een orbitale schudden (200 rpm) gedurende ongeveer 48 uur. De cellen moeten in het midden-log groeifase.
3. Pellet cellen van dubbele 1 ml monsters van de cultuur in steriele 1,7 ml snap-cap plastic centrifugebuis door centrifugeren bij 2000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig het supernatant en gooi zonder de cel pellet.
4. Was de cellen drie keer met 1 ml steriel gedistilleerd water door resuspensie gevolgd door centrifugeren om de resterende m te verwijderenedium.
5. Na de derde wasbeurt de cellen opnieuw in suspensie in 100 ml groeimedium of stikstof-honger medium.
6. Re-beënten de geresuspendeerde cellen in 10 ml vers groeimedium of 10 ml stikstof-uithongering medium. Incubeer met een orbitale schudden voor 6-12 uur de inductie van mitophagy mogelijk te maken. Na de honger te bereiden cellen voor het bekijken van fluorescentie microscopie.

Let op: Etikettering van de vacuole met CMAC-Arg

Bij de eerste test van de oprichting is het nuttig om te bevestigen onder de fluorescentie microscoop levering van Rosella naar de vacuole. Hoewel de gist vacuole is een groot organel waarvan de locatie kunnen vaak eenvoudig worden bepaald door verwijzing naar de toegezonden lichtbeelden, in sommige stammen van gist en onder bepaalde omstandigheden de groei van de vacuole kan versnipperd en moeilijk te lokaliseren.

De vacuole kan gemakkelijk worden geëtiketteerd met een coumarine-based vacuole kleurstof, zoals CMAC-Arg (7-amino-4-chloromethylcoumarin, L-arginine amide). De werking van de vacuole proteasen op de kleurstof resultaten in helder blauwe fluorescentie etikettering van de vacuole. De blauwe emissie kan gemakkelijk worden onderscheiden van de rode en groene uitstoot van Rosella ^11. Labeling met CMAC-Arg hoeft niet routinematig worden uitgevoerd, maar het wordt aanbevolen voor diegenen die niet vertrouwd zijn met de locatie en het uiterlijk van de vacuole in gist.

4. Etikettering van de vacuole met CMAC-Arg

1. Voeg de CMAC-Arg (100 mM uiteindelijke concentratie) om aan de groeiende of stikstof-uitgehongerd cellen voorafgaand aan de beeldvorming. De CMAC-Arg oplossing kan worden bereid op voorhand, maar als de oplossing is lichtgevoelig het moet worden beschermd tegen blootstelling aan licht.
2. Incubeer bij 28-30 ° C met een orbitale schudden (200 rpm) gedurende 30 minuten.
3. Pellet-cellen door centrifugeren bij 2000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
4. Giet het supernatans af.
5. Was de cellen drie keer met steriel gedistilleerd water door resuspensie gevolgd door centrifugeren om resten van het medium en overtollige CMAC-Arg kleurstof te verwijderen.
6. Monteer de cellen voor beeldvorming zoals hieronder beschreven.

5. Montage van levende gistcellen voor de confocale laser scanning microscopie (CLSM)

1. Smelt 2 mg van een laag smeltpunt agarose in afzonderlijke 1 ml aliquots groeimedium en stikstof-honger medium door incubatie bij 70 ° C. Het gesmolten agarose wordt gehandhaafd op 70 ° C.
2. Voorzichtig pellet de cellen in 1 ml porties van elk celkweek door centrifugatie bij 2000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant.
3. Was de cellen drie keer met 1 ml steriel gedistilleerd water door resuspensie en centrifugering zoals in stap 5.2.
4. Resuspendeer de gewassen cellen in 100 ul steriel gedistilleerd water.
5. Naar de cellen ter plekke 20 ul van gesmolten agarose monteren op een gelabelde glazen microscoopglaasje (76 x 26 mm).
6. Onmiddellijk spot 10 ul van de gewassen celsuspensie op het agarose bed.
7. Bedek de agarose bed met een dekglaasje (22 x 22 mm). De cellen zullen verspreid over de agarose oppervlak onder het dekglaasje.
8. Om uitdroging te voorkomen en de beweging van het dekglaasje tijdens de beeldvorming voorzichtig de randen van dekglaasje met een dunne film van nagellak.
9. Wanneer de nagellak volledig droog is (10 min) van de schuif is klaar om te bekijken door middel van fluorescentie microscopie Let op: nagellak kan schade veroorzaken aan microscoop doelstellingen.
10. Cellen gemonteerd met behulp van deze techniek kunnen worden waargenomen tot 1 uur na montage.

6. Visualiseren met behulp van autofagie CLSM

Het niveau van autofagie in een populatie van cellen wordt routinematig beoordeeld door het bepalen van het aantal cellen met rode vacuolaire fluorescentie voor en na de inductie van autofagie. Idealiter zou de progressie van autofagie wordt toegezien op geselecteerde tijdstippen na inductie van autofagie (afb. 3). Dit wordt het best uitgevoerd door visualiseren door de microscoop verrekijker. Het is belangrijk dat de juiste controles worden toegepast (bijvoorbeeld Δ atg3 mutant) en dat de microscoop instellingen blijven onveranderd tussen het observeren van verschillende monsters (bijvoorbeeld het gebruik van neutrale dichtheid filters, filter selectie).

Gistcellen zijn relatief klein die een goede kwaliteit fluorescentie microscoop (bijv. Olympus Fluoview FV500) zijn uitgerust met excitatie / emissie van geschikte filters voor de afzonderlijke visualisatie van GFP en / of pHluorin (groen fluorescentie-emissie) (FITC filter) en DsRed.T3 (rood fluorescentie-emissie) (TRITC filter).

1. Met behulp van een 60x water objectief beeld niet-uitgehongerd wild-type cellen met behulp van afwisselend de FITC en TRITC filters. Wild-type cellen zou moeten vertonen een typische cellulaire verdeling van de mitochondriën aan de rand van de cellen die zowel de rode en groene fluorescentie vertonen. Merk op dat deze verdeling van de mitochondriën is afhankelijk van de pinhole instelling van de confocale microscoop. Wij gebruiken over het algemeen een lagere pinhole waarde van 125 um die alleen kan de mitochondria in acht te nemen als een reeks van punten gelokaliseerd aan de rand van de cel (Fig. 2C), zodat de vacuole niet is ¹² verduisterd. Als een hoog pinhole waarde van (200 micrometer) wordt gebruik gemaakt van deze laat de typische filamenteuze mitochondriale netwerk verspreid over het hele cel (en de veranderingen die het ondergaat), in acht te nemen ^11. Geen enkele andere structuren in de cel moet fluorescent worden geëtiketteerd.
2. Volgorde weergeven cellen voor elk van de tijdstippen na de overdracht tot verhongering medium. Visualiseer afwisselend gebruik van de groene en rode emissie filters. Op de 6 h honger tijdstip rode fluorescentie, maar geen overeenkomstige groen-uitstoot moet herkenbaar zijn in de vacuole. Vacuolaire lokalisatie kan afzonderlijk worden bevestigd met behulp van CMAC-Arg (fig. 2C). Bekijk ~ 200 cellen en tel het aantal dat alleen rode fluorescentie in de vacuole (dat wil zeggen vacuolaire opname van mitochondria) te tonen.
3. Count vacuolaire accumulatie voor alle tijdstippen observeren> 200 cellen en dan plot percentage cellen met vacuolaire accumulatie.
4. Onderzoek autofagie-negatieve controle cellen die mt-Rosella voor de honger en na 6 uur honger.

7. Representatieve resultaten:

Hier tonen we typische resultaten verkregen met behulp van mt-Rosella, uitgedrukt in wild type en Δatg3 mutant cellen. Onder toenemende voorwaarden met ethanol als koolstofbron, zowel wild type en Δatg3 mutant cellen vertonen een cellulaire verdeling van de fluorescentie (rood en groen) typisch voor mitochondria in gistcellen. Rode en groene fluorescentie emissie wordt niet gedetecteerd in de vacuole (Fig. 2B en 2C). Wanneer het wordt blootgesteld aan honger stikstof gedurende 6 uur en verder dan, naast de rode en groene fluorescentie die overeenkomt met mitochondriën, wild-type cellen vertonen ook de ophoping van rood, maar niet groen fluorescentie in het vacuolaire lumen (Fig. 2B;. Fig 3) . Echter, in Δatg3 mutantcellen noch rood, noch groen fluorescentie accumuleert in de vacuolaire lumen (Fig. 2C;. Afb. 3).

Figuur 1. Top, regeling van organellen en compartimenten in een gistcel. Bottom, een vacuole-centric weergave van een gistcel wordt gepresenteerd met vermelding van Autofagie afbraak van de verschillende organellen en compartimenten. Sommige van de verschillen tussen de verschillende organel-specifieke vormen van autofagie (bijvoorbeeld mitophagy, nucleophagy) omvatten de specificiteit (vracht selectie) van de overspoeld inhoud, verschillende intracellulaire behoeften en extracellulaire signalen (bijvoorbeeld honger, schade), specifieke signalen, ATG genen en tijd afhankelijkheid.

Figuur 2. (A) Schematische weergave van mt-Rosella. Het mitochondriale leader sequentie (in dit geval van citraat synthase) wordt gebruikt om de Rosella biosensor doelstelling om de mitochondriale matrix. Excitatie en emissie maxima voor zowel rood fluorescerend eiwit (DsRed.T3) en groen fluorescerend eiwit (pHluorin) worden aangegeven. Bij een hoge pH (pH mitochondriale ~ 8.2) van de biosensor fluoresceert zowel rood en groen, maar bij een lage pH (pH van de vacuole ~ 5.5) het fluoresceert alleen maar rood. (B) Schematische weergave van de verwachte resultaten in het wild type en Δ atg3 mutant cellen die mt-Rosella. (C) De werkelijke resultaten verkregen door het CLSM voor wild-type cellen onder groeien en stikstof honger voorwaarden. Van links naar rechts:. DIC (verschil in contrast), RFP (DsRed.T3) fluorescentie-emissie, GFP (pHluorin) fluorescentie-emissie, CMAC-Arg fluorescentie en samen te voegen image (D) Werkelijke resultaten die zijn verkregen door middel van fluorescentie microscopie voor Datg3 mutant cellen onder groeien en stikstof honger voorwaarden. Van links naar rechts: DIC (verschil in contrast), RFP (DsRed.T3) fluorescentie-emissie, GFP (pHluorin) fluorescentie-emissie, CMAC-Arg fluorescentie en samenvoegen beeld.

Figuur 3. Het percentage van de wild-type en Δ atg3 mutantcellen uitdrukken en mt-Rosella en gegroeid onder stikstof honger, waaruit rode fluorescentie in de vacuole over een tijdsverloop van 48 uur. Het percentage cellen met accumulatie van rode fluorescentie in de vacuole werd opgenomen op 0, 6, 12, 24 en 48 uur na het begin van stikstof honger.

Discussion

In de representatieve beelden gepresenteerd in Fig. 2B en 2C is duidelijk te zien dat het gebruik van organel-specifieke tl-reporters en fluorescentie microscopie bewijs van mitochondriale lokalisatie / distributie in zowel groeiende en stikstof-uitgehongerd cellen zorgt, en maakt mitophagy kunnen worden gevisualiseerd.

Het moet worden benadrukt dat deze methode niet beperkt is tot volgende mitophagy. Autofagie van andere cellulaire componenten of organellen (bijvoorbeeld ribosomen, lipide druppels, peroxisomen, endoplasmatisch reticulum en kern) kan worden gecontroleerd met geschikte etikettering. Details van de Rosella biosensor te bouwen, celcultuur condities en typische resultaten voor de omzet van de kern (nucleophagy) zijn gemeld ^11,12 ter illustratie van de bredere toepassing van de methode.

Gebruik van organel-specifieke tl-reporters voor het toezicht op autofagie vereist een aantal overwegingen van de bouw het ontwerp te worden gehouden. Deze omvatten: (1) selectie en fusie naar de juiste targeting signaal naar organel-specifieke targeting te bereiken, (2) selectie van een geschikt fluorescerend eiwit (s), (3) sterke fluorescentie-emissie, (4) de juiste organel lokalisatie en / of verdeling binnen de cel. Zodra het organel-specifieke reporter is met succes, uitgedrukt in de gekozen gist gastheerstam een ​​tweede groep van overwegingen te worden: (1) gist groei-omstandigheden, (2) celmonster voorbereiding; (3) beeldvorming parameters zoals het belangrijk is dat de parameters geselecteerde voor CLSM (bijv. laser intensiteit, scan-rate en mode, pinhole-waarde, zoom waarde, gebruikt doelstellingen of blootstelling voor CCD-camera) worden gehandhaafd gedurende een experiment ervoor te zorgen dat vergelijkingen kunnen worden gemaakt tussen controle (groeiende cellen) en uitgehongerd monsters; ( 3) autofagie inductie en succesvolle oplevering van de verslaggever in de vacuole.

Het geheel genomen is deze fluorescentie microscopie methode is eenvoudig, relatief snel, en heeft mogelijke toepassing voor high throughput screening naar nieuwe geneesmiddelen die versterken of remmen autofagie, en ook voor de genen die reguleren of moduleren autofagie.