Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Summary

Un valido approccio per monitorare la fornitura dei organelli al lume acida del vacuolo lievito per il degrado e il riciclaggio è descritto. Il metodo si basa sulla etichettatura specifica di organelli bersaglio geneticamente codificato con un dual-emissione di fluorescenza pH biosensore, e la visualizzazione delle singole cellule mediante microscopia a fluorescenza.

Abstract

L'autofagia è importante per un fatturato di componenti cellulari sotto una serie di condizioni diverse. Serve una funzione essenziale omeostatica, nonché un meccanismo di controllo di qualità che può avere come bersaglio e di degradare selettivamente materiale cellulare tra cui organelles1-4. Per esempio, danneggiati o ridondanti mitocondri (Fig. 1), non smaltiti mediante autofagia, può rappresentare una minaccia per l'omeostasi cellulare e la sopravvivenza cellulare. Nel lievito, Saccharomyces cerevisiae, la privazione di nutrienti (ad esempio, la fame di azoto) o danni possono promuovere fatturato selettiva dei mitocondri da autofagia in un processo chiamato mitophagy ^5-9.

Descriviamo un approccio semplice microscopio a fluorescenza per valutare l'autofagia. Per maggiore chiarezza limitiamo la nostra descrizione qui per mostrare come l'approccio può essere utilizzato per monitorare mitophagy in cellule di lievito. Il saggio si avvale di un reporter fluorescente, Rosella, che è un dual-emissioni biosensore che comprende un pH relativamente stabile proteina fluorescente rossa legata ad una sensibile al pH proteina verde fluorescente. Il funzionamento di questo giornalista si basa sulle differenze di pH tra i (pH ~ 5,0-5,5) e vacuolo mitocondri (pH ~ 8.2) nelle cellule viventi. In condizioni di crescita, le cellule di tipo selvatico presentano sia fluorescenza rossa e verde, distribuito in una caratteristica forma dei mitocondri. Emissione di fluorescenza non è associato con il vacuolo. Quando sono sottoposti a fame di azoto, una condizione che induce mitophagy, oltre a fluorescenza rossa e verde etichettatura dei mitocondri, le cellule mostrano l'accumulo di rosso, ma non fluorescenza verde, nel lume acido vacuolare che rappresenta la consegna dei mitocondri al vacuolo. Segnando le cellule con il rosso, ma vacuoli fluorescente verde non può essere utilizzata come una misura di attività mitophagic nelle cellule ^5,10-12.

Protocol

Scegliendo opportunamente ceppi di lievito di controllo

Il test si basa sulla sperimentatore visivo valutare l'accumulo di fluorescenza rossa nel vacuolo lievito. Come tale, il saggio è soggettiva e si basa sulla selezione di ceppi di controllo adeguate e condizioni di crescita. Un controllo wild-type è usato per indicare i livelli di autofagia normalmente previsto. Come controllo negativo un valore nullo sforzo per l'espressione di uno dei geni del nucleo autofagia (ad esempio, ATG3) è idonea; tali ceppi non in grado di fornire materiale (ad esempio, mitocondri, nucleo) al vacuolo

1. Trasformazione di cellule di lievito con DNA plasmidico

Cellule di lievito può essere fatto facilmente competente per la trasformazione trattando con LiAcetate. Kit commerciali possono essere acquistati (ad esempio, EasyComp, Invitrogen) e protocolli pubblicati sono disponibili ^13.

In questo protocollo usiamo ceppo wild type BY4741 (MAT uno his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), e alcuni membri di una libreria completa di ceppi mutanti di eliminazione (ad esempio, Δ atg3) che ne derivano, manca ogni espressione di una diversa non essenziali del gene. La biblioteca ceppo cancellazione rappresenta uno strumento prezioso per indagare l'autofagia con Rosella basato sonde. Il giornalista impiegato in questo protocollo è mt-Rosella per mitocondri (Fig. 2A), codificato dal pAS1NB: Rosella ^mt-12.

I passi seguenti sono basate sull'uso di cellule fatte competente utilizzando il kit di trasformazione EasyComp e conservati congelati a -80 ° C per uso conveniente.

1. Equilibrare Solution III (EasyComp trasformazione Kit) a temperatura ambiente 30 minuti prima di aggiungere alle cellule di lievito.
2. Aggiungi 2-2,5 microlitri (~ 100 ng / mL) di DNA plasmide che codifica per il reporter (pAS1NB: mt-Rosella) ad una sterile 1,7 ml tappo a scatto tubo di plastica microcentrifuga.
3. Aggiungere 5 ml di sospensione appena scongelato competente di cellule di lievito e mescolare pipettando gentile.
4. Aggiungere 50 ml di soluzione III (EasyComp trasformazione Kit) e vortex per miscelare. 1.5) Incubare le reazioni di trasformazione per 1 ora a 28-30 ° C con forte mescolando ogni 15 minuti utilizzando un vortex o manualmente sfogliando il tubo con il dito.
5. Trasferire accuratamente l'impasto trasformazione di una singola piastra YMM crescita agar integrato con istidina, metionina e uracile, e delicatamente distribuire le cellule attorno alla superficie di agar con una spatola di vetro sterile. Cellule di lievito sono fragili in questa fase delicata e la gestione può aumentare la resa di trasformanti.
6. Incubare le piastre di crescita per 2 a 4 giorni a 28-30 ° C o fino a quando le colonie appaiono circa 2-3 mm di diametro.

2. Confermando l'espressione di Rosella in cellule di lievito

Prima di intraprendere esperimenti dettagliata la localizzazione corretta ed efficace espressione di Rosella dovrebbe essere confermata.

1. Utilizzando stuzzicadenti sterile selezionare per ogni singolo ceppo 5 colonie dalla piastra di trasformazione e risospendere le cellule in 50 ml di acqua sterile in separato sterile 1,7 ml tappo a scatto tubo di plastica microcentrifuga.
2. Introdurre 10 ml di ogni sospensione cellulare su vetrini separati etichettati microscopio (76 x 26 mm) e coprire la sospensione cellulare con un quadrato coprioggetto (22 x 22 mm).
3. Immediatamente esaminare le cellule per l'emissione di fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza (per esempio, Olympus Fluoview FV500). Cercare una forte fluorescenza verde e rosso e l'etichettatura tipiche di localizzazione mitocondriale (Fig. 2B e 2C).
4. Il resto di ogni colonia esaminato per fluorescenza in questo modo dovrebbe essere inoculato su un piatto fresco crescita YMM.
5. Incubare le piastre a 28-30 ° C per 2 giorni fino colonia sono di circa 2-3 mm di diametro.

3. La crescita delle cellule e l'induzione di autofagia

Autofagia può essere indotta con una serie di diverse condizioni sperimentali, tra cui l'entrata in fase stazionaria, la trasformazione in fonte di carbonio, la somministrazione di rapamicina, o per fame di azoto. Noi abitualmente uso fame di azoto come metodo per indurre mitophagy.

1. Inoculare una singola colonia in 10 ml di terreno di coltura contenente etanolo e gli integratori auxotrophic appropriato.
2. Incubare colture di lieviti a 28-30 ° C con agitazione orbitale (200 giri) per circa 48 ore. Le cellule devono essere a metà del log fase di crescita.
3. Cellule pellet da duplicare campioni 1 ml di cultura in tubi di plastica sterile 1,7 ml con tappo a scatto centrifuga per centrifugazione a 2.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela e scartare il sopranatante senza disturbare il pellet.
4. Lavare le cellule per tre volte con 1 ml di acqua distillata sterile da risospensione seguita da centrifugazione per rimuovere residui di medium.
5. Dopo il terzo lavaggio risospendere le cellule in 100 ml di terreno di coltura o di azoto fame medio.
6. Re-inoculare le cellule risospese in 10 ml di terreno di coltura fresco o 10 ml di azoto medio-fame. Incubare con agitazione orbitale per 6-12 ore per consentire l'induzione di mitophagy. Dopo aver fame preparare le cellule per la visualizzazione al microscopio a fluorescenza.

Nota: Etichettatura del vacuolo con CMAC-Arg

La prima volta che istituisce il test è utile per confermare la consegna sotto microscopio a fluorescenza di Rosella al vacuolo. Anche se il lievito vacuolo è un organulo di grandi dimensioni la cui ubicazione spesso può essere facilmente valutata in relazione alla trasmissione delle immagini della luce, in alcuni ceppi di lieviti e in alcune condizioni di crescita del vacuolo può essere frammentato e difficile da individuare.

Il vacuolo può essere facilmente etichettato con un cumarina a base dye vacuolo come CMAC-Arg (7-ammino-4-chloromethylcoumarin, L-arginina amide). L'azione della proteasi vacuolari sui risultati tintura in blu brillante etichettatura fluorescenza del vacuolo. L'emissione blu possono essere facilmente distinguibili dalle emissioni di rosso e verde di Rosella ^11. Etichettatura con CMAC-Arg non ha bisogno di essere eseguita di routine, ma è consigliato per coloro che non hanno familiarità con la posizione e l'aspetto del vacuolo nel lievito.

4. L'etichettatura del vacuolo con CMAC-Arg

1. Aggiungere il CMAC-Arg (100 concentrazione mM finale) di cellule in crescita o azoto fame prima di imaging. Il CMAC-Arg soluzione può essere preparata in anticipo, ma la soluzione è sensibile alla luce ha bisogno di essere protetti dall'esposizione alla luce.
2. Incubare a 28-30 ° C con agitazione orbitale (200 rpm) per 30 minuti.
3. Cellule pellet per centrifugazione a 2.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
4. Scartare il surnatante.
5. Lavare le cellule tre volte con acqua distillata sterile da risospensione seguita da centrifugazione per rimuovere residui di medie e superiori CMAC-Arg colorante.
6. Montare le cellule per l'imaging come descritto di seguito.

5. Montaggio cellule di lievito vivo per la microscopia confocale a scansione laser (CLSM)

1. Sciogliete 2 mg di agarosio a basso punto di fusione in separati 1 ml di mezzo di crescita e di azoto fame medio di incubazione a 70 ° C. Il fuso agarosio è mantenuta a 70 ° C.
2. Delicatamente il pellet di cellule in 1 ml di ciascuna coltura cellulare per centrifugazione a 2.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
3. Lavare le cellule per tre volte con 1 ml di acqua distillata sterile da risospensione e centrifugazione, come al punto 5.2.
4. Risospendere le cellule lavate in 100 ml di acqua distillata sterile.
5. Per montare il posto celle 20 l di fuso agarosio su un vetrino da microscopio etichettati di vetro (76 x 26 mm).
6. Immediatamente posto 10 ml di sospensione cellulare lavato sul letto di agarosio.
7. Coprite il letto di agarosio con un coprioggetto (22 x 22 mm). Le cellule si diffonderà su tutta la superficie agarosio sotto il vetrino.
8. Per prevenire la disidratazione e il movimento del coprioggetto durante l'imaging con attenzione sigillare i bordi del coprioggetto con un sottile strato di smalto.
9. Quando lo smalto è completamente asciutto (10 min) il vetrino è pronto a vista da Attenzione microscopia a fluorescenza: smalto per unghie può causare danni agli obiettivi microscopio.
10. Celle montate con questa tecnica si possono osservare fino a 1 ora dopo il montaggio.

6. Autofagia visualizzare utilizzando CLSM

Il livello di autofagia in una popolazione di cellule è regolarmente valutato determinando il numero di cellule che mostrano fluorescenza rossa vacuolare prima e dopo l'induzione di autofagia. Idealmente la progressione della autofagia è monitorato in momenti selezionati a seguito di induzione di autofagia (Fig. 3). Questo è il miglior eseguita da visualizzare attraverso il microscopio binoculare. E 'importante che i controlli corretti sono impiegati (ad esempio, Δ atg3 mutanti) e che le impostazioni microscopio rimangono invariate tra l'osservazione di campioni diversi (ad esempio, l'uso di filtri a densità neutra, selezione del filtro).

Cellule di lievito sono relativamente piccole che richiedono un buon microscopio a fluorescenza di qualità (ad esempio, Olympus Fluoview FV500) dotato di eccitazione / emissione di appositi filtri per la visualizzazione separata di GFP e / o pHluorin (emissione di fluorescenza verde) (FITC filtro) e DsRed.T3 (rosso emissione di fluorescenza) (TRITC filtro).

1. Utilizzando un obiettivo 60x vista l'acqua non morire di fame le cellule wild-type utilizzando alternativamente i filtri FITC e TRITC. Cellule wild-type dovrebbe mostrare una distribuzione tipica dei mitocondri cellulari alla periferia delle cellule che mostrano sia la fluorescenza rossa e verde. Si noti che questa distribuzione dei mitocondri dipende dalla Pinhole regolazione del microscopio confocale. Noi di solito utilizzare un valore inferiore a foro stenopeico di 125 micron, che consente solo i mitocondri da osservare come una serie di punti localizzati alla periferia della cellula (Fig. 2C) in modo che il vacuolo non è oscurata ^12. Se un valore alto di foro stenopeico (200 micron) viene usato questo permette la tipica rete filamentosa mitocondriale distribuiti in tutta la cella (e le modifiche che subisce), da osservare ^11. Nessun altre strutture nella cella deve essere fluorescente.
2. Sequenzialmente vista cellule per ciascuno dei punti di tempo dopo il trasferimento a medio fame. Visualizzare alternativamente usando i filtri emissione verde e rosso. Alla fame 6 fluorescenza tempo h punto rosso, ma nessuna emissione corrispondenti verde dovrebbe essere distinguibili nel vacuolo. Localizzazione vacuolare possono essere separatamente confermata usando CMAC-Arg (Fig. 2C). Vista ~ 200 celle e contare il numero che mostrano solo fluorescenza rossa nel vacuolo (assorbimento cioè vacuolare dei mitocondri).
3. Conte accumulo vacuolare per tutti i punti tempo di osservazione> 200 celle e poi trama percentuale di cellule che mostrano accumulo vacuolare.
4. Esaminare l'autofagia-negativi cellule di controllo che esprimono mt-Rosella prima di morire di fame e di inedia dopo 6 ore.

7. Rappresentante dei risultati:

Qui vi mostriamo i risultati tipici ottenuti con mt-Rosella, espresso in wild-type e Δatg3 cellule mutanti. In condizioni di crescita con l'etanolo come fonte di carbonio, sia di tipo selvatico e Δatg3 cellule mutanti mostrano una distribuzione cellulare di fluorescenza (rosso e verde) tipico dei mitocondri nelle cellule di lievito. Rosso e verde emissione di fluorescenza non viene rilevata nel vacuolo (Fig. 2B e 2C). Quando sono sottoposti a fame di azoto per 6 ore e poi di là, oltre a fluorescenza rossa e verde corrispondente ai mitocondri, le cellule di tipo selvatico mostrano anche l'accumulo di rosso, ma non fluorescenza verde nel lume vacuolare (Fig. 2B;. Fig. 3) . Tuttavia, in Δatg3 cellule mutanti fluorescenza né rosso né verde si accumula nel lume vacuolare (Fig. 2C;. Fig. 3).

Figura 1. Top, schema di organelli e compartimenti in una cellula di lievito. In basso, un vacuolo-centric vista di una cellula di lievito è presentato indicando il degrado autofagici di organelli diversi scomparti. Alcune delle differenze tra i vari organelli specifici tipi di autofagia (ad esempio, mitophagy, nucleophagy) includono la specificità (selezione carico) dei contenuti inghiottito, varie esigenze intracellulari e segnali extracellulari (ad esempio, la fame, danni), segnali specifici, ATG geni e la dipendenza del tempo.

Figura 2. (A) Rappresentazione schematica di mt-Rosella. La sequenza capo mitocondriale (in questo caso di citrato sintasi) è utilizzato per indirizzare il biosensore Rosella alla matrice mitocondriale. Eccitazione ed emissione massimi per entrambi proteina fluorescente rossa (DsRed.T3) e proteina fluorescente verde (pHluorin) sono indicati. A pH elevato (mitocondriale pH ~ 8.2) il biosensore fluorescente rosse e verdi, invece, a basso pH (pH vacuolare ~ 5,5) è solo rosso fluorescente. (B) Rappresentazione schematica dei risultati attesi nel wild-type e Δ atg3 cellule mutanti che esprimono mt-Rosella. (C) I risultati effettivi ottenuti CLSM per le cellule di tipo selvatico in crescita e le condizioni di fame di azoto. Da sinistra a destra:. DIC (differenza di contrasto), RFP (DsRed.T3) emissione di fluorescenza, GFP (pHluorin) emissione di fluorescenza, CMAC-Arg fluorescenza e immagine si fondono (D) I risultati effettivi ottenuti al microscopio a fluorescenza per Datg3 cellule mutanti sotto in crescita e le condizioni di fame di azoto. Da sinistra a destra: DIC (differenza di contrasto), RFP (DsRed.T3) emissione di fluorescenza, GFP (pHluorin) emissione di fluorescenza, CMAC-Arg fluorescenza e immagine si fondono.

Figura 3. La percentuale di wild-type e Δ atg3 cellule mutanti, esprimendo mt-Rosella e cresciuti sotto la fame di azoto, che mostra fluorescenza rossa nel vacuolo per un durata di 48 ore. La percentuale di cellule che mostrano accumulo di fluorescenza rossa nel vacuolo è stato registrato a 0, 6, 12, 24 e 48 ore dopo l'inizio fame di azoto.

Discussion

Nelle immagini rappresentative presentato in fig. 2B e 2C si può chiaramente vedere che l'uso di reporter fluorescenti organelli specifici e microscopia a fluorescenza fornisce la prova di localizzazione mitocondriale / distribuzione sia in crescita e di azoto a corto di cellule, e permette mitophagy da visualizzare.

E 'da sottolineare che questo metodo non si limita a mitophagy seguente. Autofagia di altri componenti cellulari o organelli (ad esempio, i ribosomi, gocce lipidiche, perossisomi, reticolo endoplasmatico e nucleo) possono essere monitorati con un'adeguata etichettatura. Dettagli del costrutto biosensore Rosella, condizioni di coltura cellulare e risultati tipici per il fatturato del nucleo (nucleophagy) sono stati segnalati ^11,12 illustrano la più ampia applicazione del metodo.

L'uso di giornalisti fluorescenti organello specifico per l'autofagia monitoraggio richiede diverse considerazioni di design costruire da tenere in mente. Questi includono: (1) la selezione e la fusione al segnale appropriato targeting per raggiungere organello-specifici mirati, (2) selezione di una proteina fluorescente adatto (s), (3) forte emissione di fluorescenza, (4) corretta localizzazione degli organelli e / o distribuzione all'interno della cellula. Una volta che l'organello specifico giornalista è stata espressa con successo nel paese ospitante ceppo di lievito selezionato un secondo gruppo di considerazioni diventano: (1) le condizioni di crescita del lievito, (2) preparazione dei campioni di cellule, (3) i parametri di imaging, come è importante che i parametri selezionati per CLSM (ad esempio, l'intensità del laser, frequenza e la modalità, il valore foro stenopeico, valore di zoom, obiettivi utilizzati o di esposizione per i CCD-camera) sono mantenuti per tutto un esperimento garantire che possano essere effettuati raffronti tra il controllo (cellule in crescita) e di campioni affamati; ( 3) induzione autofagia e di successo la consegna del giornalista nel vacuolo.

In generale, questo metodo di microscopia a fluorescenza è facile, relativamente veloce, e ha potenziale applicazione per lo screening ad alto rendimento per i nuovi farmaci che migliorano o inibire l'autofagia, e anche per i geni che regolano o modulano l'autofagia.