酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

Summary

劣化とリサイクルのための酵母の液胞の酸性内腔に細胞小器官の配信を監視するための堅牢なアプローチが説明されています。方法は、遺伝的に符号化されたデュアルエミッション蛍光のpHバイオセンサー、及び蛍光顕微鏡を使用して、個々の細胞の可視化とターゲットの細胞小器官の特定のラベルに依存しています。

Abstract

オートファジーは、異なる条件の範囲内での細胞成分の代謝回転のために重要です。それは本質的な恒常性維持機能だけでなく、ターゲットと選択的organelles1 - 4を含む細胞物質を低下させる可能性の品質管理機構を提供しています。例えば、オートファジーによる処分ではない、（図1）ミトコンドリア損傷または冗長な、細胞のホメオスタシスと細胞の生存に脅威を表すことができます。酵母では、 サッカロマイセスセレビシエ 、栄養枯渇（例えば、窒素飢餓）または損傷がmitophagy ^5月9日と呼ばれるプロセスにおけるオートファジーによるミトコンドリアの選択的なターンオーバーを促進することができます。

我々は、オートファジーを評価するためにシンプルな蛍光顕微鏡のアプローチを説明します。明確にするために我々はアプローチが酵母細胞にmitophagyを監視するために使用する方法を示すためにここでの説明を制限する。アッセイは、pH感受性の緑色蛍光タンパク質にリンクされている比較的pHが安定赤色蛍光タンパク質を含むデュアルエミッションバイオセンサーである蛍光レポーター、ローゼ、利用しています。この記者の操作は、生きた細胞の液胞（pH約5.0〜5.5）とミトコンドリア（pH約8.2）の間のpHの違いに依存しています。栽培条件下では、野生型細胞はミトコンドリアの方法の特性に分布し、赤色と緑色蛍光の両方を示す。蛍光発光は、液胞に関連付けられていません。窒素飢餓にさらされたとき、mitophagy誘導条件は、赤とミトコンドリアを標識する緑色蛍光に加えて、細胞は液胞へのミトコンドリアの配信を表す酸性液胞内腔に、緑色の蛍光を赤色の蓄積を示すが、ではない。赤ではなく、緑色蛍光液胞で得点細胞は細胞^5,10-12でmitophagic活性の尺度として使用することができます。

Protocol

適切なコントロールの酵母株を選択する

アッセイは、視覚的に酵母の液胞の赤色蛍光の蓄積を評価する実験者に依存しています。このようなアッセイとして主観的であり、適切な対照株と成長条件の選択に依存しています。野生型のコントロールは、通常期待されるオートファジーのレベルを示すために使用されます。ネガティブコントロールとして、コアのオートファジー遺伝子の一つ（例えば、ATG3）の発現のためのひずみはnullが適しています。このような菌株は、液胞に（例えば、ミトコンドリア、核）材料を提供することはできません

1。プラスミドDNAによる酵母細胞の形質転換

酵母細胞は容易にLiAcetateで処理することにより、形質転換用のコンピテントにすることができます。市販のキットを購入（例えば、EasyComp、Invitrogen社）と発表されたプロトコルが¹³用意されていますことがあります。

このプロトコルでは、野生型株BY4741（MAThis3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0を ）、およびそれから派生した欠失変異株（例えば、Δatg3）、別の非必須遺伝子の各欠けて発現の包括的なライブラリの一部のメンバーを使用してください。欠失株ライブラリはローゼラベースのプローブを使用してオートファジーを調査するための貴重なツールを表します。 MT -ローゼラ^12：このプロトコルで用いられるレポーターはpAS1NBでエンコードされたミトコンドリア用のmt -ローゼラ（ 図2A）、です。

次の手順は、細胞の使用に基づいています。EasyComp変換キットを使用して有能なものや便利な使用のための° Cは、-80℃で凍結保存。

1. 30分酵母細胞に添加する前に室温にソリューションIIIを（EasyComp変換キット）平衡化させます。
2. 滅菌1.7ミリリットルスナップキャップのプラスチックのマイクロ遠心チューブへ：レポーターをコードするプラスミドDNA（MT -ローゼラpAS1NB）の2から2.5μlを（〜は100 ng /μl）を添加。
3. 有能な酵母細胞の新鮮​​な融解懸濁液5μlを追加し、穏やかなピペッティングにより混和する。
4. 混在させるソリューションIII（EasyComp変換キット）と渦の50μlを追加します。 1.5）精力的にまたは手動で指でチューブをタッピングしボルテックスミキサーを用いて15分ごとに混合しながら28〜30 ° Cで1​​時間の変換反応をインキュベートする。
5. 慎重にメチオニンとウラシル、ヒスチジンを添加した単YMM寒天の成長板に形質転換混合物を転送し、そして穏やかに滅菌ガラススプレッダーと寒天の表面の周囲にセルを配信します。酵母細胞は、この段階で壊れやすく、穏やかなハンドリングでは、形質転換体の収量を増やすことができます。
6. 28〜30℃で2〜4日またはコロニーは直径2-3 mm程度表示されるまで、成長板をインキュベートする。

2。酵母細胞でローゼラの発現を確認

詳細な実験に着手する前にローゼラの正しい局在と効率的な発現を確認してください。

1. 滅菌つまようじを使用すると、別の滅菌1.7ミリリットルスナップキャッププラスチック製のマイクロ遠心チューブに滅菌水50μlの形質転換プレートを再懸濁します細胞から各系統5つのシングルコロニーを選択してください。
2. プレイス10別のラベルが付いた顕微鏡用スライドガラス（76 × 26 mm）の上にそれぞれの細胞懸濁液の液と正方形のカバー（22 × 22 mm）の細胞懸濁液をカバーしています。
3. 直ちに蛍光顕微鏡（例えば、オリンパスFluoview FV500）を使用して蛍光発光のための細胞を調べます。強い緑色と赤色蛍光とミトコンドリア局在した（ 図2Bおよび2C）の典型的なラベルを探します。
4. このように蛍光を調べた各コロニーの残りの部分は、新鮮なYMMの成長板に接種すべきである。
5. 2日間28〜30 ° Cでインキュベートプレートは、コロニーまでは直径で約2〜3 mmである。

3。オートファジーの細胞増殖および誘導

オートファジーは、固定相、炭素源、ラパマイシンの投与、または窒素飢餓の変化への参入を含む、さまざまな実験条件、の数を用いて誘導することができる。我々は日常的にmitophagyを誘導する方法として、窒素飢餓を使用。

1. エタノールと適切な栄養要求性のサプリメントを含む増殖培地10mlにシングルコロニーを植菌。
2. 約48時間の軌道振とう（200rpm）して28〜30℃で酵母培養物をインキュベートする。細胞は中期対数増殖期にある必要があります。
3. 室温で2分間2,000 × gで遠心分離によって滅菌1.7ミリリットルスナップキャップのプラスチック遠心管における文化の重複1ミリリットルの試料から、細胞をペレット化する。慎重に細胞ペレットを乱すことなく上清を除去し捨てる。
4. 残留mを除去するために遠心分離に続いて再懸濁1 mlの滅菌蒸留水で細胞を3回洗浄edium。
5. 後にサード洗浄は、成長培地または窒素飢餓培地100 mlに細胞を懸濁します。
6. 新鮮な増殖培地または10ミリリットル窒素飢餓培地10mlに懸濁している細胞を再接種する。 mitophagyの誘導を可能にするために6〜12時間の軌道に振とうしながらインキュベートする。飢餓後に蛍光顕微鏡で見るための細胞を準備する。

注：CMAC - Argを持つ液胞の標識

第1のアッセイを確立するときには、液胞へローゼラの蛍光顕微鏡の配信で確認すると便利です。酵母の液胞には、場所が頻繁に簡単に酵母の一部の菌株ではと液胞が断片化し、見つけるのが困難であると思われるいくつかの成長条件の下で、透過光の画像を参照して決定することができる大規模な細胞小器官ですが。

液胞は、容易にそのようなCMAC -アルギニン（7 - アミノ-4 - chloromethylcoumarin、L -アルギニンアミド）などのクマリン系液胞色素を用いて標識することができます。液胞の明るい青色の蛍光標識色素結果に関する液胞プロテアーゼの作用。青色発光が容易にローゼラ¹¹の赤と緑の排出量を区別することができます。 CMAC - Argでラベリングは、日常的に実行する必要はありませんが、それは酵母の液胞の位置と外観に慣れていない方にお勧めです。

4。 CMAC - Argで液胞の標識

1. 成長や窒素飢餓細胞イメージングの前にCMAC - Argを（100mMの最終濃度）を追加します。 CMAC - Argのソリューションは、事前に準備されていましたが、解決策は光に敏感なので、それは光への曝露から保護する必要がありますすることができます。
2. 30分間軌道振とう（200rpm）して28〜30℃でインキュベートする。
3. 室温で2分間2,000 × gで遠心分離により細胞をペレット化する。
4. 上清を捨てる。
5. 残留培地と過剰CMAC - Argの色素を除去するために遠心分離に続いて再懸濁によって滅菌蒸留水で細胞を3回洗浄する。
6. 後述するようにイメージングのための細胞をマウントします。

5。共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）のライブ酵母細胞の取り付け

1. 70℃でインキュベートすることによって、増殖培地と窒素飢餓培地の別々の1mlのアリコートに低融点アガロース2mgを溶かす溶融アガロースを70℃に維持する
2. 穏やかにペレットを室温で2分間2,000 × gで遠心分離により各細胞培養液1mlアリコートの細胞と上清を捨てる。
3. ステップ5.2のように再懸濁と遠心分離で1 mlの滅菌蒸留水で細胞を3回洗浄する。
4. 滅菌蒸留水100μlの洗浄した細胞を再懸濁します。
5. ラベルの付いたガラスの顕微鏡スライド（76 × 26 mm）の上に溶融アガロースの細胞のスポット20μlをマウントするには。
6. 直ちにアガロースベッドの上に洗浄細胞懸濁液10μlを見つける。
7. カバースリップ（22 × 22 mm）のアガロースのベッドカバー。細胞はカバースリップの下にアガロースの表面全体に行き渡ります。
8. 撮像中にカバースリップの脱水と動きを防ぐために慎重にマニキュアの薄膜でカバースリップの端をシールします。
9. マニキュアが完全に乾燥したら（10分）スライドは蛍光顕微鏡の用心して表示する準備ができています：マニキュアは、顕微鏡対物レンズへのダメージを引き起こす可能性があります。
10. 細胞は、この技術が実装後1時間まで観察することができます使用してマウントされた。

6。 CLSMを用いて可視化するオートファジー

細胞集団におけるオートファジーのレベルは、日常的にオートファジーの誘導前と後の赤空胞の蛍光を示す細胞の数を決定することによって評価される。理想的にはオートファジーの進行は、オートファジーの誘導（ 図3）に続く、選択した時点で監視されます。これは最高の顕微鏡の双眼を通して視覚化することによって行われます。それは、正しいコントロールが採用されていることが重要です（例えば、Δatg3変異体）と顕微鏡の設定は、異なるサンプル（例えば、減光フィルターの使用、フィルタ選択）観察の間に変更されないままという。

酵母細胞は、GFPおよび/またはpHluorinの別々の可視化（緑色蛍光発光）に適した励起/発光フィルターを装備した質の良い蛍光顕微鏡（例えば、オリンパスFluoview FV500）（FITCフィルター）を必要とする比較的小さいとDsRed.T3（赤蛍光発光）（TRITCフィルター）。

1. 交互にFITCとTRITCフィルターを使用して非飢えた野生型の細胞は60倍の水の客観的なビューを使用する。野生型細胞では、赤と緑の両方の蛍光を示す細胞の周囲にミトコンドリアの典型的な細胞分布を示すべきである。ミトコンドリアのこの分布はpinhに依存していることに注意してください共焦点顕微鏡のOLE設定。通常、私たちはミトコンドリアが液胞は^、12を隠されていないようにセルの周囲（ 図2C）に局在する一連のドットとして観察することができるように125μmの低いピンホールの値を使用してください。の高いピンホールの値（200μmに）使用されている場合、これは典型的な糸状ミトコンドリアネットワーク^11を観察する（そしてそれが受ける変化）細胞全体に分散できます。セル内の他の構造体は、蛍光標識されないことがあります。
2. 順次飢餓培地への転送は、次のタイムポイントごとのセルを見る。緑色と赤色の発光フィルターを使用して交互に視覚化する。 6時間飢餓時時点赤色蛍光で、しかし、対応する緑色発光は、液胞の識別可能でなければいけません。液胞局在性は、個別にCMAC -アルギニン（ 図2C）を用いて確認することができます。ビュー〜200細胞と液胞（ミトコンドリアのすなわち液胞の取り込み）でのみ赤色蛍光を示す数を数えます。
3. > 200セルし、液胞蓄積を示すセルのプロットの割合を観察するすべての時間ポイントのために液胞蓄積を数える。
4. 飢餓前にMT -ローゼラを発現し、6時間の飢餓をオートファジーに続く陰性コントロール細胞を調べます。

7。代表的な結果：

ここで、我々は、野生型とΔatg3変異細胞で発現してMT -ローゼラを、使用して得られた典型的な結果を示す。エタノールで栽培条件下で炭素源として、野生型とΔatg3変異体細胞の両方は、酵母細胞内のミトコンドリアの典型的な蛍光（赤と緑）の細胞内分布を示す。赤色と緑色の蛍光発光は、液胞（ 図2Bおよび2C）で検出されていません。 6時間、窒素飢餓を受け、その後を超えて、赤やミトコンドリア、野生型の細胞に対応する緑色の蛍光に加えても液胞内腔の緑色蛍光ではない赤の蓄積を示すが、ときに（ 図2B、図3） 。しかし、Δatg3変異細胞では赤も緑もない蛍光は液胞内腔（。図3】図2C）に蓄積する。

図1 トップ 、酵母細胞内小器官とコンパートメントのスキーム。底は、酵母細胞の液胞を中心としたビューは、異なるオルガネラとコンパートメントのオートファジー劣化を示す表示されます。オートファジーの様々なオルガネラ固有の型（例えば、mitophagy、nucleophagy）の違いの一部は 、ATG、巻き込ま内容、様々な細胞内のニーズや外手がかりの特異性（貨物の選択）（例えば、飢餓、損傷）、特定の信号が含まれています遺伝子と時間依存性。

図2。 MT -ローゼラの（A）の模式図。ミトコンドリアのリーダー配列は、（クエン酸シンターゼのこのケースでは）ミトコンドリアマトリックスにローゼラバイオセンサーを対象とするために使用されています。赤色蛍光タンパク質（DsRed.T3）と緑色蛍光タンパク質の両方の励起と発光極大（pHluorin）が示されます。高pH（ミトコンドリアpH約8.2）で、バイオセンサーは、それが唯一の赤の蛍光を発する低pH（液胞のpH〜5.5）で、しかし、赤と緑の両方蛍光を発する。発現する野生型とΔatg3変異細胞で期待した結果の（B）の回路図表現は、成長と窒素飢餓条件下で野生型の細胞のためにCLSMで得られたMT -ローゼラ。（C）実績。左から右へ：下Datg3変異細胞の蛍光顕微鏡によって得られたDIC（コントラストの違い）、RFP（DsRed.T3）蛍光発光、GFP（pHluorin）の蛍光発光、CMAC - Argの蛍光とマージの画像（D）実績成長と窒素飢餓条件。左から右へ：DIC（コントラストの違い）、RFP（DsRed.T3）蛍光発光、GFP（pHluorin）の蛍光発光、CMAC - Argの蛍光とマージのイメージ。

図3。48時間の時間の経過とともに液胞に赤色蛍光を示すMT -ローゼラを表現し、窒素飢餓下で成長し、野生型とΔatg3変異細胞、、の割合。液胞に赤色蛍光の蓄積を示す細胞の割合は、窒素飢餓を開始後0、6、12、24および48時間で記録されました。

Discussion

図に示した代表的な画像で。 2Bと2Cは、それがはっきりとオルガネラ特異的蛍光レポーターと蛍光顕微鏡の使用は、成長と窒素飢餓細胞の両方におけるミトコンドリア局在/ディストリビューションの証拠を提供し、視覚化されるmitophagyことができることがわかる。

それは、このメソッドは、次mitophagyに限定されていないことを強調することです。他の細胞成分や細胞小器官（例えば、リボソーム、脂質滴、ペルオキシソーム、小胞体や核）のオートファジーは、適切なラベルを使用して監視することができます。ローゼラバイオセンサーの構造、細胞の培養条件と核の売上高（nucleophagy）の典型的な結果の詳細は、メソッドのより広範なアプリケーションを示す^11,12を報告されている。

モニタリングオートファジーのためのオルガネラ特異的蛍光レポーターの使用は、構造設計のいくつかの考慮事項を念頭に保持する必要があります。これらは、（1）細胞小器官特異的ターゲティングを達成するための適切な標的シグナルの選択と融合、適切な蛍光タンパク質（s）の（2）選択、（3）強い蛍光発光が、（4）正しい細胞小器官の局在および/または細胞内分布。オルガネラ特異的レポーターが正常に選択された酵母の宿主中で発現されるとなる検討事項の第二のグループを、ひずみ：（1）酵母の成長条件、（2）細胞の試料調製、（3）の撮像パラメータは、パラメータが選択されていることが重要であるとしてCLSMのために（例えば、レーザーの強度、速度とモード、ピンホールの値、ズーム値、使用目的やCCDカメラの露出をスキャン）の比較を制御（増殖中の細胞）と飢えたサンプル間行うことができることを確実に実験を通して維持されます。（ 3）オートファジーの誘導と液胞へのレポーターの配信が正常に完了したが。

全体的に、この蛍光顕微鏡法は、比較的早く、簡単で、オートファジーを促進または阻害する新規薬剤のため、とにもオートファジーを制御するまたは調節する遺伝子のハイスループットスクリーニングのための潜在的なアプリケーションを持っています。