Summary
גישה חזקים כדי לפקח על משלוח של האברונים את לומן חומצי של vacuole את השמרים במשך השפלה ומיחזור מתואר. השיטה מסתמכת על תיוג הספציפי של האברונים היעד עם פלואורסצנטי כפול פליטת מקודדים גנטית pH-biosensor, ויזואליזציה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Abstract
Autophagy חשוב מחזור של רכיבים סלולריים תחת מגוון של תנאים שונים. זה ממלא תפקיד חיוני homeostatic וכן בקרת איכות מנגנון שיכול היעד סלקטיבי לבזות חומר הסלולר כולל organelles1-4. לדוגמה, פגום או מיותר המיטוכונדריה (איור 1), לא מסולק על ידי autophagy, יכול לייצג איום על הומאוסטזיס הסלולר הישרדות התא. ב השמרים, Saccharomyces cerevisiae, חסך תזונתי (למשל, רעב חנקן) או נזק יכול לקדם מחזור סלקטיבית של המיטוכונדריה על ידי autophagy בתהליך שמכונה mitophagy 5-9.
אנו מתארים גישה פשוטה מיקרוסקופ פלואורסצנטי להעריך autophagy. לשם הבהירות אנו להגביל את התיאור שלנו כאן כדי להראות עד כמה הגישה ניתן להשתמש כדי לפקח mitophagy בתאי שמרים. Assay עושה שימוש כתב ניאון, רוזלה, המהווה biosensor כפול הפליטה הכוללת חלבון יחסית-pH יציב ניאון אדום קשור חלבון ה-pH רגיש פלואורסצנטי ירוק. המבצע של הכתב הזה מסתמך על ההבדלים בין ה-pH (5.0-5.5 pH ~) vacuole ו (pH 8.2 ~) המיטוכונדריה בתאים חיים. תחת תנאי גידול, סוג התאים בר התערוכה הן פלואורסצנטי אדום וירוק מופץ מאפיין בצורה של המיטוכונדריה. פליטת הקרינה לא קשורה vacuole. כאשר נתון רעב חנקן, מצב אשר גורם mitophagy, בנוסף פלואורסצנטי אדום וירוק תיוג במיטוכונדריה, תאים התערוכה הצטברות של האדומים, אבל לא פלואורסצנטי ירוק, את לומן vacuolar חומצי המייצג את המסירה של המיטוכונדריה כדי vacuole. ניקוד תאים עם אדום, אבל vacuoles ניאון ירוק לא יכול לשמש כמדד לפעילות mitophagic בתאים 5,10-12.
Protocol
בחירת זני שמרים מתאים לשלוט
Assay מסתמך על הנסיין חזותית להערכת הצטברות של פלואורסצנטי אדום vacuole את השמרים. ככזה assay הוא סובייקטיבי והוא מסתמך על הבחירה של זנים בקרה מתאימים לתנאי הגידול. השליטה סוג בר משמש כדי לציין את רמות autophagy צפוי כרגיל. כביקורת שלילית null זן ביטוי של אחד הגנים autophagy הליבה (למשל, ATG3) מתאים; זנים כאלה לא יכולים לספק חומר (למשל, מיטוכונדריה, גרעין) כדי vacuole
1. טרנספורמציה של תאים שמרים עם DNA פלסמיד
בתאי שמרים יכול להתבצע בקלות המוסמכת לשינוי על ידי טיפול עם LiAcetate. ערכות מסחרי ניתן לרכוש (למשל, EasyComp, Invitrogen) ופרוטוקולים שפורסם הזמינים 13.
בפרוטוקול זה אנו משתמשים זן פראי סוג BY4741 (MAT his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), וכמה חברי ספריה מקיפה של זנים המחיקה מוטציה (לדוגמא, Δ atg3) הנגזר ממנו, כל ביטוי חסר של גנים שאינם חיוניים שונים. הספרייה זן המחיקה מהווה כלי רב ערך עבור חוקרים autophagy באמצעות רוזלה מבוסס בדיקות. הכתב המועסקים פרוטוקול זה MT-רוזלה עבור המיטוכונדריה (איור 2 א), המקודדים על ידי pAS1NB: MT-12 רוזלה.
השלבים הבאים מבוססים על שימוש בתאי עשה המוסמכת באמצעות ערכת טרנספורמציה EasyComp ומאוחסנים קפוא ב -80 מעלות לשימוש נוח.
- לאזן פתרון III (EasyComp טרנספורמציה קיט) לטמפרטורת החדר 30 דקות לפני הוספת לתאי שמרים.
- הוסף 2-2.5 μl (~ 100 ng / μl) של ה-DNA פלסמיד קידוד הכתב (pAS1NB: MT-רוזלה) כדי סטרילי 1.7 Snap-כובע צינור פלסטיק microcentrifuge מ"ל.
- הוסף 5 μl של השעיה מופשר טרי של תאים השמרים ומערבבים המוסמכת על ידי pipetting עדין.
- הוסף 50 μl של פתרון III (EasyComp טרנספורמציה Kit) ו מערבולת לערבב. 1.5) דגירה התגובות שינוי במשך שעה 1 ב 28-30 מעלות צלזיוס עם נמרצת ערבוב כל 15 דקות בעזרת מערבל מערבולת או באופן ידני על ידי מצליף את הצינור עם האצבע.
- להעביר בזהירות את תערובת הטרנספורמציה על צלחת אגר יחיד YMM צמיחה להשלים עם היסטידין, מתיונין אורציל, בעדינות להפיץ את התאים סביב פני השטח של אגר עם מפזר כוס סטרילית. בתאי שמרים הם שבירים בשלב זה טיפול עדין יכולים להגדיל את התשואה של transformants.
- דגירה לוחיות הצמיחה ל -2 עד 4 ימים ב 28-30 מעלות צלזיוס או עד מושבות להופיע כ 2-3 מ"מ קוטר.
2. אישור ביטוי רוזלה בתאי שמרים
לפני שהחלו ניסויים מפורט לוקליזציה הנכון ביטוי יעיל של רוזלה חייבת להיות מאושרת.
- בעזרת קיסמים סטרילי לבחור עבור כל 5 מושבות זן יחיד מהצלחת את השינוי ותאי resuspend ב 50 μl מים סטריליים נפרד סטרילי 1.7 Snap-כובע צינור פלסטיק microcentrifuge מ"ל.
- מקום 10 μl של השעיה על כל תא נפרד שכותרתו מיקרוסקופ שקופיות הזכוכית (76 x 26 מ"מ) ולכסות את ההשעיה תא עם coverslip מרובע (22 x 22 מ"מ).
- מיד לבדוק את התאים עבור פליטת הקרינה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (למשל, אולימפוס Fluoview FV500). חפש פלואורסצנטי ירוק ואדום חזק תיוג טיפוסי של לוקליזציה המיטוכונדריה (איור 2B ו - 2C).
- יתר מושבה כל בדקו עבור הקרינה בדרך זו צריך להיות מחוסן על צלחת YMM טרי צמיחה.
- צלחות לדגור על 28-30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים עד המושבה כ 2-3 מ"מ קוטר.
3. תא צמיחה של אינדוקציה autophagy
Autophagy יכול להיגרם באמצעות מספר תנאים ניסויים שונים, כולל הכניסה לשלב נייח, שינוי מקור פחמן, מנהלה של rapamycin, רעב או חנקן. אנו משתמשים באופן שגרתי רעב חנקן כשיטת לגרום mitophagy.
- לחסן מושבה יחיד לתוך 10 מ"ל של מדיום גידול המכיל אתנול תוספי auxotrophic המתאים.
- דגירה תרבויות שמרים ב 28-30 מעלות צלזיוס עם רעד מסלולית (200 סל"ד) למשך כ 48 שעות. התאים צריכים להיות בשלב אמצע יומן צמיחה.
- גלולה תאים מדגימות 1ml לשכפל תרבות סטרילי 1.7 Snap-כובע מ"ל צינורות פלסטיק על ידי צנטריפוגה צנטריפוגה XG ב 2000 למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים בזהירות וזורקים supernatant מבלי להפריע לתא גלולה.
- לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1 מ"ל מים מזוקקים סטריליים על ידי resuspension ואחריו צנטריפוגה להסיר מ שיוריתedium.
- לאחר לשטוף third resuspend התאים 100 מ"ל של מדיום הגידול או חנקן רעב בינוני.
- Re-לחסן את התאים resuspended לתוך 10 מ"ל של מדיום הגידול טריים או 10 חנקן רעב בינוני מ"ל. דגירה עם רעד מסלולית 6-12 שעות כדי לאפשר גיוס של mitophagy. לאחר רעב להכין תאים לצפייה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
הערה: תיוג של vacuole עם CMAC-Arg
כאשר לייסד assay כדאי לאשר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המסירה של רוזלה כדי vacuole. למרות vacuole שמרים הוא אברון גדול שמיקומו יכול בקלות להיות לעתים קרובות נקבעת על ידי התייחסות תמונות האור המועבר, כמה זנים של שמרים תחת כמה תנאים לצמיחה vacuole יכול להיות מקוטעת קשה לאתר.
Vacuole יכול להיות מתויג בקלות באמצעות צבע coumarin מבוססי vacuole כגון CMAC-Arg (7-אמינו-4-chloromethylcoumarin, L-ארגנין אמיד). הפעולה של פרוטאזות vacuolar על תוצאות לצבוע ב תיוג בהיר הקרינה הכחול של vacuole. פליטת הכחול ניתן להבחין בקלות מן פליטת אדום וירוק של רוזלה 11. סימון CMAC-Arg אינו צריך להתבצע באופן שגרתי, אך מומלץ למי שלא מכיר את המיקום והמראה של vacuole של שמרים.
4. תיוג של vacuole עם CMAC-Arg
- מוסיפים את CMAC-Arg (100 mM הריכוז הסופי) לתאים לגדול או חנקן מורעבים לפני הדמיה. הפתרון CMAC-Arg יכול להיות מוכן מראש, אבל הפתרון הוא אור רגיש זה צריך להיות מוגן מפני חשיפה לאור.
- לדגור על 28-30 מעלות צלזיוס עם רעד מסלולית (200 סל"ד) במשך 30 דקות.
- גלולה תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- בטל supernatant.
- לשטוף את התאים שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים על ידי resuspension ואחריו צנטריפוגה להסיר בינוני שיורית עודף CMAC-Arg לצבוע.
- הר תאים הדמיה כמתואר להלן.
5. הרכבה שמרים תאים חיים עבור מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר (CLSM)
- ממיסים 2 מ"ג של נקודת התכה נמוכה agarose ב 1 aliquots נפרד מ"ל של מדיום צמיחה חנקן רעב בינוני על ידי דוגרים על 70 ° C. Agarose מותך נשמר על 70 ° C.
- גלולה בעדינות את התאים aliquots 1 מ"ל של התרבות כל תא על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר להתעלמות supernatants.
- לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1 מ"ל מים מזוקקים סטריליים על ידי resuspension ו צנטריפוגה כמו בשלב 5.2.
- Resuspend התאים לרחוץ 100 μl של מים מזוקקים סטריליים.
- כדי לעלות את התאים במקום 20 μl של agarose מותכת על שקופיות מיקרוסקופ שכותרתו זכוכית (76 x 26 מ"מ).
- מיד במקום 10 μl של ההשעיה תא שטף על המיטה agarose.
- כיסוי המיטה agarose עם coverslip (22 x 22 מ"מ). התאים יתפשט על פני השטח agarose מתחת coverslip.
- כדי למנוע התייבשות תנועת coverslip במהלך הדמיה בזהירות לאטום את הקצוות של coverslip עם סרט דק של לק.
- כאשר הלק יבש לחלוטין (10 דקות) להחליק את מוכנה להציג באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי היזהרו: לק יכול לגרום נזק מטרות מיקרוסקופ.
- תאים רכוב באמצעות טכניקה זו ניתן לראות עד שעה 1 אחרי הרכבה.
6. Autophagy חזותי באמצעות CLSM
רמת autophagy באוכלוסייה של תאים נבחנת באופן שוטף על ידי קביעת מספר התאים מראה הקרינה vacuolar אדום לפני ואחרי הגיוס של autophagy. באופן אידיאלי התקדמות של autophagy מנוטר בנקודות זמן נבחר בעקבות גיוס של autophagy (איור 3). זה מבוצע על ידי מיטב לדמיין דרך המשקפת את המיקרוסקופ. חשוב לתקן את פקדי מועסקים (למשל, Δ atg3 מוטציה) וכי את ההגדרות מיקרוסקופ להישאר ללא שינוי בין התבוננות מדגמים שונים (למשל, שימוש במסננים צפיפות ניטרלי, בחירת מסנן).
בתאי שמרים הם קטנים יחסית הדורשים איכות טובה מיקרוסקופ פלואורסצנטי (למשל, אולימפוס Fluoview FV500) מצויד עירור / פליטה מסננים מתאימים להדמיה נפרד של ה-GFP ו / או pHluorin (ירוק פליטת הקרינה) (FITC מסנן) ו DsRed.T3 (אדום פליטת הקרינה) (TRITC מסנן).
- באמצעות תצוגה 60x אובייקטיבי מים שאינם מורעבים תאים סוג בר שימוש לסירוגין את המסננים FITC ו TRITC. תאים מסוג Wild צריך התערוכה חלוקה תאית טיפוסית של המיטוכונדריה בשולי התאים המציגים הן פלואורסצנטי אדום וירוק. שים לב כי זה הפצה של המיטוכונדריה תלוי pinhהגדרת OLE של המיקרוסקופ confocal. אנחנו בדרך כלל להשתמש בערך חריר התחתון של 125 מיקרומטר שרק מאפשר המיטוכונדריה כדי לצפות כסדרה של נקודות מקומיות בפריפריה של התא (איור 2C) כך vacuole לא מוסתר 12. אם ערך חריר גבוהה (200 מיקרומטר) משמש זה מאפשר לרשת טיפוסי המיטוכונדריה פילמנטיות מופץ ברחבי התא (ואת השינויים שהוא עובר) כדי לצפות 11. אין מבנים אחרים בתא צריך להיות שכותרתו fluorescently.
- ברצף להציג תאים עבור כל אחד את הנקודות הבאות להעביר זמן עד בינוני רעב. דמיינו לסירוגין באמצעות מסנני פליטה ירוק ואדום. בבית 6 שעות זמן הקרינה רעב נקודה אדומה, אך ללא פליטת ירוק המקביל צריך להיות ניתן להבחין vacuole. לוקליזציה Vacuolar ניתן לאשר בנפרד באמצעות CMAC-Arg (איור 2C). צפה ~ 200 תאים לספור את מספר המציגים רק פלואורסצנטי אדום vacuole (כלומר ספיגת vacuolar של המיטוכונדריה).
- הרוזן הצטברות vacuolar עבור כל נקודות זמן התבוננות> 200 תאים ולאחר מכן אחוז העלילה של תאים המציג הצטברות vacuolar.
- בדוק autophagy שלילי תאים מלאה להביע MT-רוזלה לפני מרעב בעקבות 6 שעות רעב.
7. נציג התוצאות:
כאן, אנו מציגים תוצאות טיפוסי שהושגו באמצעות MT-רוזלה, לידי ביטוי בסוג בר Δatg3 תאים מוטנטים. תחת תנאי גידול עם האתנול כמקור פחמן, הן סוג בר Δatg3 תאים מוטנטים התערוכה חלוקה של הקרינה הסלולרית (אדום וירוק) טיפוסי המיטוכונדריה בתאי שמרים. אדום ירוק פליטת הקרינה לא מזוהה ב vacuole (איור 2B ו - 2C). כאשר נתון רעב חנקן במשך 6 שעות ומעבר אז, בנוסף פלואורסצנטי אדום וירוק המתאים המיטוכונדריה, סוג התאים פרא גם התערוכה הצטברות של האדומים, אבל לא פלואורסצנטי ירוק את לומן vacuolar (איור 2B;. איור 3) . עם זאת, Δatg3 תאים מוטנטים פלואורסצנטי אדום ולא ירוק מצטבר לומן vacuolar (איור 2C;. איור 3).
איור 1. לראש, תכנית של אברונים ותאים בתא שמרים. התחתונה, נוף vacuole ממוקדת של תא שמרים הוא הציג המציין השפלה autophagic של אברונים ותאים שונים. חלק מן ההבדלים בין אברון ספציפי סוגים שונים של autophagy (למשל, mitophagy, nucleophagy) כוללים את סגוליות (מבחר מטען) של תוכן אפף, צרכים תאיים שונים אותות תאיים (למשל, הרעבה, נזק), אותות ספציפיים, ATG גנים תלות בזמן.
איור 2. (א) ייצוג סכמטי של MT-רוזלה. רצף מנהיג המיטוכונדריה (במקרה זה של synthase ציטרט) משמש למטרה biosensor רוזלה ל מטריקס המיטוכונדריה. עירור ופליטה מקסימום חלבון הן ניאון אדום (DsRed.T3) ו חלבון פלואורסצנטי ירוק (pHluorin) מצוינים. ב-pH גבוה (pH המיטוכונדריה ~ 8.2) biosensor מאיר שני אדומים וירוקים, לעומת זאת, ב-pH נמוך (pH vacuolar ~ 5.5) זה מאיר אדום בלבד. (ב) ייצוג סכמטי של התוצאות הצפויות בסוג בר Δ atg3 תאים מוטנטים מביע MT-רוזלה. (ג) התוצאות בפועל מתקבל על ידי CLSM עבור תאים מסוג בר תחת גדל רעב תנאים חנקן. משמאל לימין:. DIC (הבדל בניגוד), RFP (DsRed.T3) פליטת הקרינה, GFP (pHluorin) פליטת הקרינה, CMAC-Arg הקרינה ואת התמונה המיזוג (ד ') התוצאות בפועל מתקבל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Datg3 תאים מוטנטים תחת גדל רעב תנאים חנקן. משמאל לימין: DIC (הבדל בניגוד), RFP (DsRed.T3) פליטת הקרינה, GFP (pHluorin) פליטת הקרינה, CMAC-Arg הקרינה ואת התמונה המיזוג.
איור 3. אחוז סוג בר Δ תאים atg3 מוטציה, להביע MT-רוזלה גדלה תחת רעב חנקן, מראה פלואורסצנטי אדום vacuole במהלך תקופה של 48 שעות. אחוז התאים מראה הצטברות של הקרינה אדום vacuole נרשמה ב 0, 6, 12, 24 ו - 48 שעות לאחר תחילת רעב חנקן.
Discussion
בתמונות שהוצגו נציג איור. 2B ו - 2C ניתן לראות בבירור כי השימוש אברון ספציפי כתבים פלורסנט מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספק ראיות של לוקליזציה והפצה המיטוכונדריה / בגידול והן חנקן מורעבים התאים, ומאפשר mitophagy להיות דמיינו.
זה יש להדגיש כי שיטה זו אינה מוגבלת mitophagy הבאה. Autophagy של מרכיבים תאיים אחרים או אברונים (למשל, הריבוזומים, טיפות השומנים, peroxisomes, reticulum endoplasmic ואת הגרעין) עשוי להיות במעקב עם תיוג מתאים. פרטי לבנות את biosensor רוזלה, תרבות תנאים התא תוצאות אופייני מחזור של גרעין (nucleophagy) דווחו 11,12 הממחישות את היישום הרחב יותר של השיטה.
השימוש אברון ספציפי כתבים ניאון עבור autophagy ניטור דורש כמה שיקולים של תכנון לבנות כדי לזכור. אלה כוללים: (1) סלקציה היתוך האות המיקוד המתאים כדי להשיג אברון ספציפי מיקוד, (2) בחירה של חלבון פלואורסצנטי מתאים (ים): (3) פליטת הקרינה חזקה; (4) לתקן לוקליזציה אברון ו / או חלוקה בתוך התא. לאחר הכתב אברון ספציפי באה לידי ביטוי בהצלחה מארח את השמרים נבחר זן קבוצה שנייה של שיקולים להיות: (1) צמיחה שמרים תנאים; (2) מדגם הכנה התא; (3) הדמיה פרמטרים כמו חשוב הפרמטרים שנבחרו עבור CLSM (למשל, עוצמת הלייזר, סריקה קצב ומצב, ערך חריר, ערך הזום, מטרות שימוש או חשיפה CCD-מצלמה) נשמרות לאורך ניסוי להבטיח כי ניתן לבצע השוואות בין שליטה (תאים גדל) דגימות רעב: ( 3) אינדוקציה autophagy ומוצלחת המסירה של כתב לתוך vacuole.
בסך הכל, זו שיטה מיקרוסקופית פלורסנט קל, מהיר יחסית, ויש לו פוטנציאל היישום ההקרנה תפוקה גבוהה עבור תרופות חדישות המשפרות או לעכב autophagy, וכן גנים המווסתים או לווסת autophagy.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר האוסטרלי גרנט DP0986937.
References
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- He, C., Klionsky, D. J. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy. Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009).
- Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40, 280-293 (2010).
- Camougrand, N., Kissová, I., Salin, B., Devenish, R. J. Monitoring mitophagy in yeast. Methods Enzymol. 451, 89-107 (2008).
- Yen, W. L., Klionsky, D. J. How to live long and prosper: autophagy, mitochondria, and aging. Physiology (Bethesda). 23, 248-262 (2008).
- Tolkovsky, A. M. Mitophagy. Biochim. Biophys. Acta. 1793, 1508-1515 (2009).
- Bhatia-Kissová, I., Camougrand, N. Mitophagy in yeast: actors and physiological roles. FEMS Yeast Res. 10, 1023-1034 (2010).
- Kanki, T., Klionsky, D. J. The molecular mechanism of mitochondria autophagy in yeast. Mol. Microbiol. 75, 795-800 (2010).
- Nowikovsky, K., Reipert, S., Devenish, R. J., Schweyen, R. J. Mdm38 protein depletion causes loss of mitochondrial K+/H+ exchange activity, osmotic swelling and mitophagy. Cell Death Differ. 14, 1647-1656 (2007).
- Devenish, R. J., Prescott, M., Turcic, K., Mijaljica, D. Monitoring organelle turnover in yeast using fluorescent protein tags. Methods Enzymol. 451, 109-131 (2008).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4, 205-213 (2008).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).
