Недорогие, высокая пропускная способность метода для одновременного обнаружения до 43 молекулярных мишеней описано. Применение mPCR / RLB включают набрав микробного и обнаружение нескольких возбудителей из клинических образцов.
Мультиплекс ПЦР / Обратная линия блот гибридизация анализа позволяет обнаруживать до 43 молекулярных мишеней в 43 образцах с помощью одной мультиплексной ПЦР реакции следуют зонда гибридизации на нейлоновую мембрану, которая повторного использования. Зонды 5 'амин изменена, чтобы фиксации мембраны. Грунтовки 5 'биотин изменение, которое позволяет обнаружения гибридизированных продуктов ПЦР с использованием стрептавидин-пероксидазы и хемилюминесцентный субстрат с помощью светочувствительной пленке. При низкой установки и затраты на расходные материалы, эта технология является недорогой (около 2 долл. США в выборке), высокая пропускная способность (несколько мембраны могут быть обработаны одновременно) и короткие сроки выполнения работ (около 10 часов).
Метод может быть использован в ряде направлений. Несколько зонды могут быть предназначены для обнаружения последовательности изменения в пределах одного усиленный продукт, или несколько продуктов могут быть усилены одновременно, с одним (или более) зонды используются для последующего обнаружения. Сочетание обоих подходов также может быть использован в рамках одного теста. Возможность включать несколько зондов для одной последовательности целевой делает анализ весьма специфичны.
Опубликованные приложения mPCR / RLB обнаружения включают антибиотик 1,2 генов устойчивости, введя метициллин-резистентный золотистый стафилококк 3-5 и Salmonella SP 6, молекулярной серотипирование Пневмококк 7,8, Streptococcus agalactiae 9 и энтеровирусы 10,11, идентификация микобактерий SP 12, выявление половых 13-15 и дыхательных путей 16 и 17 другими патогенами и обнаружения и идентификации mollicutes 18. Тем не менее, универсальность средств технического применения практически безграничны и не ограничивается молекулярного анализа микроорганизмов.
Пять шагов в mPCR / RLB являются: а) Primer и зонда дизайн, б) выделения ДНК и ПЦР-амплификации с) подготовка мембраны, г) Гибридизация и обнаружения, и д) Регенерация мембраны.
MPCR / RLB метод позволяет одновременное обнаружение большого количества ампликонов ПЦР. Из-за высокой чувствительности хемилюминесцентный зонд основе обнаружения, одной мультиплексной ПЦР реакция с большим количеством пар праймеров могут быть использованы для усиления ДНК.
Если ни один датчик сигналов, полученных с одного или нескольких образцов, проведение гель-электрофореза с любой оставшийся продукт ПЦР может помочь отличить, является ли проблема с ПЦР-амплификации или зонда гибридизации. Там, где все сигналы датчика на мембране являются слабыми или отсутствуют, но гель-электрофореза указывает на успешное ПЦР-амплификации, возможности включают проблемы с маркировки мембрану, неправильной регенерации мембран после предыдущего использования, неправильной температуре во время инкубации гибридизации или стрептавидин, или дефектные стрептавидином сопряженных пероксидазы или обнаружения реагента.
Если контрольные пробы показывают, что отдельные зонды может производить ложные отрицательные сигналы, один ПЦР с гелем основе выявления и последующего секвенирования могут быть выполнены, чтобы проверить усиления ПЦР-продукт и искать последовательность изменения в сайт связывания зонда. Слабый или отсутствующий датчик сигнала может быть связано с большим размером ампликона: если возможно все ампликонов должна быть такой же длины и менее 300 бп. Вторичные структуры ДНК ампликонов также может привести к плохой обязательным зонд и может привести к ре-дизайн праймеров. Индивидуальные грунтовки или зонд концентрации могут также быть изменены для оптимизации сигнала.
Ложные положительные сигналы из-за связывания зонда nonamplified грунтовок или праймер-димеров продукт может быть исследована путем проведения ПЦР с одного на основе геля обнаружения и последующего секвенирования. Если это произойдет, редизайн зондов, которые могут потребоваться. Точечные мутации в сайтах связывания зонда может привести к слабой или отсутствия сигналов. Разрешение двух зондов для каждого продукта усиливается делает это легко обнаружить. Эта особенность может быть использована с тщательной грунтовки и зонда дизайн для обнаружения малых изменений последовательности ДНК-мишени.
Таким образом, в то время как Есть много методов обнаружения следующих продуктов мультиплекс ПЦР доступны, mPCR / RLB имеет преимущество в том, высокую пропускную способность и недорогую установку с низким затрат. Гибкость метода позволяет использовать его в для широкого спектра применений.
The authors have nothing to disclose.
Мэттью О `Салливан и Фэй Чжоу являются получателями Австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета последипломного Стипендии медицинских исследований.
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
5′ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20×20 cm | PALL life sciences | 74480C | |
Deionised, purified water | |||
Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche | 11 089 153 001 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18×24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
Ice |
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Scientific | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
The Belly Dancer rocking platform | Stovall life science | Euro BDbo | |
Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
Water bath | |||
Suction | |||
Hot plate | |||
Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film |
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.