Un método de bajo costo, de alto rendimiento para la detección simultánea de hasta 43 blancos moleculares se describe. Las solicitudes de MPCR / RLB son la tipificación de microorganismos y la detección de múltiples patógenos de muestras clínicas.
Multiplex PCR / ensayo de línea inversa Blot hibridación permite la detección de hasta 43 blancos moleculares en 43 muestras con un multiplex PCR seguida de hibridación de la sonda en una membrana de nylon, que es re-utilizable. Las sondas son 5 'amina modificado para permitir la fijación de la membrana. Los iniciadores son 5 'con biotina modificado que permite la detección de hibridación productos PCR utilizando estreptavidina-peroxidasa y un sustrato quimioluminiscente a través de la película fotosensible. Con una configuración de baja y los costos de consumo, esta técnica es de bajo costo (alrededor de 2 dólares EE.UU. por ejemplo), de alto rendimiento (las membranas múltiples pueden ser procesadas al mismo tiempo) y tiene un tiempo de respuesta corto (aproximadamente 10 horas).
La técnica puede ser utilizada en un número de maneras. Múltiples sondas pueden ser diseñados para detectar variaciones de secuencia dentro de un solo producto amplificado, o varios productos se pueden amplificar de forma simultánea, con una (o más) sondas utilizadas para la detección posterior. Una combinación de ambos enfoques también se puede utilizar dentro de un único ensayo. La posibilidad de incluir múltiples sondas para una secuencia de un solo objetivo hace que el ensayo muy específico.
Las aplicaciones publicadas de MPCR / RLB incluyen la detección de resistencia a los antibióticos 1,2 genes, la tipificación de Staphylococcus aureus resistente a meticilina 3-5 y Salmonella sp 6, serotipificación molecular del Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 y 10,11 enterovirus, la identificación de Mycobacterium sp 12, la detección de las verrugas genitales y del tracto respiratorio 13-15 16 y otros 17 agentes patógenos y la detección e identificación de mollicutes 18. Sin embargo, la versatilidad de la técnica significa que las aplicaciones son prácticamente ilimitadas, y no se limita al análisis molecular de los microorganismos.
Los cinco pasos de MPCR / RLB son un manual) y el diseño de la sonda, b) la extracción de ADN y la amplificación por PCR c) Preparación de la membrana, d) La hibridación y detección, y e) La regeneración de la membrana.
El método MPCR / RLB permite la detección simultánea de un gran número de amplicones de PCR. Debido a la alta sensibilidad de la sonda quimioluminiscente la detección basada en una sola reacción de PCR multiplex con un gran número de pares de iniciadores se pueden utilizar para ampliar la plantilla de ADN.
Si no hay señales de la sonda se obtienen con una o más muestras, la realización de la electroforesis en gel con cualquier resto de producto de PCR puede ayudar a distinguir si el problema es con la amplificación por PCR o hibridación de la sonda. Donde todas las señales de la sonda en la membrana son débiles o inexistentes, pero la electroforesis en gel indica el éxito de amplificación de PCR, las posibilidades incluyen problemas con el etiquetado de la membrana, la regeneración incorrecta de la membrana después de su uso anterior, las temperaturas incorrectas durante la incubación, la hibridación o estreptavidina, o defectuoso estreptavidina peroxidasa o reactivo de detección.
Si las muestras de control indican que las sondas individuo puede estar produciendo falsas señales negativas, solo con gel de PCR basada en la detección y posterior secuenciación se puede realizar para verificar la amplificación del producto de PCR y en busca de variación de la secuencia en el sitio de la sonda vinculante. Señal de la sonda débil o ausente puede ser debido al gran tamaño de amplificación: si es posible todos los amplicones debe ser de similar longitud y menos de 300 pb. Estructuras secundarias del ADN de los amplicones también se puede producir vinculante sonda pobres, y puede ser necesario re-diseño de los cebadores. Cartilla individual o concentraciones de la sonda también se puede variar para optimizar la potencia de la señal.
Señales de falsos positivos debido a la sonda de la unión de los primers no amplificados o un producto de imprimación dímero puede ser investigado por realizar un solo PCR con gel basado en la detección y posterior secuenciación. Si esto ocurre, el rediseño de las sondas pueden ser necesarios. Las mutaciones puntuales en los sitios de unión de la sonda puede dar lugar a señales débiles o ausentes. Permitiendo dos sondas para cada producto amplificado lo hace fácil de detectar. Esta característica puede ser explotada con imprimación y cuidado diseño de la sonda para detectar pequeñas variaciones en la secuencia de ADN diana.
En resumen, si bien hay muchos métodos de detección de los productos siguientes multiplex PCR reacciones disponibles, MPCR / RLB tiene la ventaja de ser de alto rendimiento y de bajo costo con una baja configuración de los costos. La flexibilidad del método permite su uso en una amplia gama de aplicaciones.
The authors have nothing to disclose.
Mateo O'Sullivan y Zhou Fei son los destinatarios de Salud Nacional de Australia y el Consejo de Investigación Médica de Postgrado Becas de Investigación Médica.
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
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5′ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20×20 cm | PALL life sciences | 74480C | |
Deionised, purified water | |||
Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche | 11 089 153 001 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18×24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
Ice |
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
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Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Scientific | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
The Belly Dancer rocking platform | Stovall life science | Euro BDbo | |
Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
Water bath | |||
Suction | |||
Hot plate | |||
Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film |
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.