שיטה זולה, תפוקה גבוהה לגילוי סימולטני של עד 43 מטרות מולקולריות מתואר. יישומים של mPCR / RLB כוללים הקלדה וזיהוי של חיידקים פתוגנים רבים של דוגמאות קליניות.
Multiplex PCR / קו הפוך כתם assay הכלאה מאפשרת זיהוי של עד 43 מטרות מולקולריות ב 43 דגימות באמצעות אחד ה-PCR זמנית תגובה ואחריו הכלאה בדיקה על קרום ניילון, אשר מחדש שמיש. בדיקות הן אמין "5 שונה על מנת לאפשר קיבוע על הממברנה. Primers הם ביוטין 5 "שונה המאפשר זיהוי של הכלאה מוצרים באמצעות PCR streptavidin-peroxidase ואת המצע chemiluminescent באמצעות סרט רגיש. עם ההתקנה עלויות נמוכות מתכלים, טכניקה זו היא זולה (כ 2 $ ארה"ב לפי המדגם), קצב העברת נתונים גבוה (ממברנות מרובים יכול להיות מעובד בו זמנית) ויש לו זמן תגובה קצר (כ 10 שעות).
הטכניקה ניתן להשתמש במספר דרכים. בדיקות מרובות ניתן נועד לזהות וריאציה רצף בתוך מוצר מוגבר אחד, או מספר רב של מוצרים יכול להיות מוגבר בעת ובעונה אחת, עם אחד (או יותר) בדיקות לגילוי שימוש לאחר מכן. השילוב של שתי הגישות יכול לשמש גם בתוך assay אחד. היכולת לכלול בדיקות מרובות רצף מטרה אחת עושה assay מאוד ספציפיות.
פורסם יישומים של mPCR / RLB כוללים זיהוי של גנים 1,2 התנגדות לאנטיביוטיקה, הקלדה של סטפילוקוקוס עמידים-methicillin 3-5 ו סלמונלה sp 6, serotyping המולקולרי של Streptococcus pneumoniae 7,8, סטרפטוקוקוס agalactiae 9 ו enteroviruses 10,11, זיהוי של Mycobacterium sp 12, זיהוי של המין 13-15 ו – 16 בדרכי הנשימה ועוד 17 פתוגנים איתור וזיהוי של mollicutes 18. עם זאת, את צדדיות של הטכניקה אמצעי יישומים בלתי מוגבלות כמעט ולא מוגבלת ניתוח מולקולרית של מיקרואורגניזמים.
חמשת השלבים mPCR / RLB הם פריימר) ועיצוב החללית, ב) מיצוי דנ"א הגברה PCR ג) הכנת הממברנה, ד) הכלאת זיהוי, ו-e) התחדשות של הממברנה.
השיטה mPCR / RLB היתרי זיהוי סימולטני של מספר רב של amplicons PCR. בשל הרגישות הגבוהה של בדיקה לגילוי מבוססי chemiluminescent, זמנית יחיד PCR תגובה עם מספר גדול של זוגות פריימר יכול לשמש כדי להגביר את תבנית ה-DNA.
אם לא מתקבלים אותות בדיקה עם אחד או יותר דגימות, ביצוע אלקטרופורזה בג'ל עם מוצר ה-PCR הנותרים יכולה לסייע להבחין אם הבעיה היא עם הגברה PCR או הכלאה בדיקה. איפה כל אותות בדיקה על הממברנה חלשים או נעדרים, אבל ג'ל אלקטרופורזה מציין מוצלח הגברה PCR, האפשרויות כוללות בעיות עם תיוג של הממברנה, התחדשות שגוי של קרום לאחר השימוש הקודם, טמפרטורות נכונות במהלך הדגירה הכלאה או streptavidin, או פגום streptavidin- peroxidase המצומד או מגיב לגילוי.
אם דגימות בקרת עולה כי בדיקות בודדים ניתן לייצר אותות שלילי כוזב, PCR יחיד עם זיהוי הג'ל מבוסס רצף הבאות ניתן לבצע כדי לוודא הגברה של מוצר ה-PCR ולחפש וריאציה רצף באתר מחייב בדיקה. אות בדיקה חלש או נעדר יכול להיות בגלל גודל amplicon גדול: אם אפשר amplicons כל צריך להיות באורך דומה פחות מ -300 נ"ב. מבנה ה-DNA משני של amplicons יכול גם לייצר מחייב בדיקה עני, ועלול להצריך עיצוב מחדש של ספרי לימוד. פריימר בודדת או ריכוזי בדיקה עשוי גם להיות מגוונות כדי לייעל את עוצמת האות.
אותות חיוביים False בשל מחייב בדיקה של primers nonamplified או פריימר-dimer המוצר יכול להיחקר על ידי ביצוע PCR יחיד עם זיהוי הג'ל מבוסס רצף הבאים. במקרה זה, עיצוב מחדש של בדיקות ניתן חייבה. מוטציות נקודתיות באתרים מחייב בדיקה עלולה להוביל אותות חלשים או נעדרים. מתן שתי בדיקות עבור כל מוצר מוגבר עושה את זה קל לזהות. מאפיין זה עשוי להיות מנוצל עם פריימר זהיר ועיצוב בדיקה כדי לזהות שינויים קטנים ב-DNA רצף היעד.
לסיכום, בעוד ישנן שיטות רבות של זיהוי המוצר הבא תגובה זמנית PCR זמין, mPCR / RLB יש את היתרון של להיות תפוקה גבוהה וזול, עם עלויות התקנה נמוכות. הגמישות של השיטה היתרי השימוש בו למגוון רחב של יישומים.
The authors have nothing to disclose.
מתיו או 'סאליבן ואת פיי ג'ואו הם מקבלי האוסטרלית הלאומית לבריאות המועצה למחקר רפואי לתארים מתקדמים מלגות למחקר רפואי.
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
5′ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20×20 cm | PALL life sciences | 74480C | |
Deionised, purified water | |||
Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche | 11 089 153 001 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18×24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
Ice |
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Scientific | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
The Belly Dancer rocking platform | Stovall life science | Euro BDbo | |
Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
Water bath | |||
Suction | |||
Hot plate | |||
Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film |
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.