मल्टीप्लेक्स पीसीआर और रिवर्स रेखा ब्लाट संकरण परख (mPCR / RLB)
Summary
एक सस्ती, 43 आणविक लक्ष्य तक की एक साथ पता लगाने के लिए उच्च throughput विधि वर्णित है. MPCR / RLB के आवेदन माइक्रोबियल टाइपिंग और नैदानिक नमूनों से कई रोगज़नक़ों का पता लगाने में शामिल हैं.
Abstract
मल्टीप्लेक्स पीसीआर / रिवर्स रेखा ब्लाट संकरण परख एक मल्टीप्लेक्स पीसीआर एक नायलॉन झिल्ली, जो फिर से प्रयोग करने योग्य है पर जांच संकरण द्वारा पीछा प्रतिक्रिया का उपयोग 43 नमूनों में 43 आणविक लक्ष्य तक का पता लगाने की अनुमति देता है. जांच 5 'झिल्ली को निर्धारण की अनुमति के लिए संशोधित amine कर रहे हैं. प्राइमर्स हैं 5 'बायोटिन संशोधित जो संकरित पीसीआर streptavidin peroxidase और सहज फिल्म के माध्यम से एक chemiluminescent सब्सट्रेट का उपयोग उत्पादों का पता लगाने की अनुमति देता है. कम सेटअप और उपभोज्य लागत के साथ, इस तकनीक सस्ती है (अमेरिकी डॉलर प्रति नमूना लगभग 2), उच्च (एक साथ कई झिल्ली संसाधित किया जा सकता है) throughput और एक छोटे प्रतिवर्तन समय (लगभग 10 घंटे) है.
तकनीक तरीके का एक संख्या में उपयोग किया जा सकता है. एकाधिक जांच के लिए एक एकल उत्पाद प्रवर्धित भीतर अनुक्रम भिन्नता का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है, या एक साथ कई उत्पादों परिलक्षित किया जा सकता है, एक (या अधिक) बाद में पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जांच के साथ. दोनों तरीकों का एक संयोजन भी एक एकल परख के भीतर इस्तेमाल किया जा सकता है. एक ही लक्ष्य अनुक्रम के लिए कई जांच को शामिल करने की क्षमता परख अत्यधिक विशिष्ट बनाता है.
MPCR / RLB के प्रकाशन अनुप्रयोगों के लिए एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों 1,2 का पता लगाने में शामिल हैं, Methicillin प्रतिरोधी Staphylococcus aureus 3-5 और साल्मोनेला 6 एसपी, स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया 7,8, 9 स्ट्रैपटोकोकस agalactiae और 10,11 enteroviruses, पहचान की आणविक serotyping के टाइप माइकोबैक्टीरियम सपा 12, 13-15 जननांग और श्वसन पथ के 16 और अन्य 17 रोगज़नक़ों और पता लगाने और 18 mollicutes की पहचान का पता लगाने के के . हालांकि, तकनीक के बहुमुखी प्रतिभा का मतलब है अनुप्रयोगों वस्तुतः असीमित है और सूक्ष्म जीवों की आणविक विश्लेषण करने के लिए सीमित नहीं हैं.
mPCR / RLB में पांच चरणों में एक प्राइमर) और जांच डिजाइन, ख) डीएनए निष्कर्षण और पीसीआर प्रवर्धन ग) झिल्ली की तैयारी, घ) संकरण और पहचान कर रहे हैं, और ई) झिल्ली के उत्थान.
Protocol
Discussion
विधि / mPCR RLB पीसीआर amplicons की एक बड़ी संख्या के साथ – साथ पता लगाने के परमिट. Chemiluminescent जांच के आधार पर पता लगाने के उच्च संवेदनशीलता की वजह से, प्राइमर जोड़े की बड़ी संख्या के साथ एक एकल मल्टीप्लेक्स पीसीआर प्रतिक्रिया डीएनए टेम्पलेट बढ़ाना इस्तेमाल किया जा सकता है.
यदि कोई जांच संकेतों को एक या एक से अधिक नमूने, किसी भी शेष पीसीआर उत्पाद के साथ जेल वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन के साथ प्राप्त कर रहे हैं मदद कर सकता है भेद कि क्या समस्या पीसीआर प्रवर्धन या जांच के संकरण के साथ है. झिल्ली पर सभी जांच संकेतों कहाँ कमजोर या अनुपस्थित रहे हैं, लेकिन जेल वैद्युतकणसंचलन सफल पीसीआर प्रवर्धन इंगित करता है, संभावनाओं झिल्ली की लेबलिंग के साथ समस्याओं, पिछले उपयोग के बाद झिल्ली के गलत उत्थान, संकरण या streptavidin ऊष्मायन के दौरान गलत तापमान, या दोषपूर्ण शामिल streptavidin- peroxidase संयुग्म या पता लगाने अभिकर्मक.
यदि नियंत्रण के नमूनों से संकेत मिलता है कि अलग – अलग जांच के उत्पादन हो झूठी नकारात्मक संकेतों, जेल आधारित पता लगाने और बाद में अनुक्रमण के साथ एक पीसीआर पीसीआर उत्पाद के प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए और जांच बाध्यकारी साइट पर अनुक्रम बदलाव के लिए देखो करने के लिए किया जा सकता है है हो सकता है. कमजोर या अनुपस्थित जांच संकेत बड़े amplicon आकार के कारण हो सकता है: यदि संभव हो तो सभी amplicons समान लंबाई और 300 से कम बीपी होना चाहिए. Amplicons माध्यमिक डीएनए संरचना को भी गरीब जांच बंधन का उत्पादन कर सकते हैं और प्राइमरों की फिर से डिजाइन की जरूरत हो सकती है. व्यक्तिगत प्राइमर या जांच सांद्रता भी सिग्नल की शक्ति का अनुकूलन करने के लिए विविध किया जा सकता है.
झूठी सकारात्मक nonamplified प्राइमरों या प्राइमर – डिमर उत्पाद के बंधन जांच के कारण संकेतों जेल आधारित पता लगाने और बाद में अनुक्रमण के साथ एक पीसीआर प्रदर्शन द्वारा जांच किया जा सकता है. यदि ऐसा होता है, जांच को नया स्वरूप देना जरूरी किया जा सकता है. प्वाइंट जांच बाध्यकारी साइटों में म्यूटेशनों कमजोर या अनुपस्थित संकेतों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. प्रवर्धित प्रत्येक उत्पाद के लिए दो जांच की अनुमति दे इस का पता लगाने के लिए आसान बनाता है. यह विशेषता सावधान प्राइमर और जांच डिजाइन के लक्ष्य डीएनए में छोटे अनुक्रम विविधताओं का पता लगाने के साथ शोषण किया जा सकता है.
संक्षेप में, जबकि वहाँ उत्पाद का पता लगाने निम्नलिखित मल्टीप्लेक्स पीसीआर उपलब्ध प्रतिक्रियाओं के कई तरीके हैं mPCR / RLB कम सेटअप लागत के साथ उच्च throughput और सस्ती होने का लाभ है. विधि के लचीलेपन में आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इसके प्रयोग परमिट.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
मैथ्यू O'Sullivan और फी झोउ ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद स्नातकोत्तर चिकित्सा अनुसंधान छात्रवृत्ति के प्राप्तकर्ता हैं.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 5′ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
| 20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
| BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20×20 cm | PALL life sciences | 74480C | |
| Deionised, purified water | |||
| Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
| Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche | 11 089 153 001 | |
| Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
| Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
| OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
| Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18×24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
| Ice |
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
| Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Scientific | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
| The Belly Dancer rocking platform | Stovall life science | Euro BDbo | |
| Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
| Water bath | |||
| Suction | |||
| Hot plate | |||
| Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
| X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film |
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.
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