43分子標的までの同時検出のための安価な、高スループットの方法が記載されている。 mPCR / RLBのアプリケーションでは、微生物のタイピングと臨床検体から複数の病原体の検出を含む。
マルチプレックスPCR /リバースラインブロットハイブリダイゼーションアッセイは、再使用可能なナイロンメンブレン上のプローブのハイブリダイゼーションの前に1つのマルチプレックスPCR反応を用いて43試料の43分子標的までの検出を可能にする。プローブは、膜に固定できるように手を加えた5'アミンです。プライマーは、ストレプトアビジン – ペルオキシダーゼと感光膜を介して化学発光基質を用いてハイブリダイズしたPCR産物の検出を可能にする5'ビオチン変更されている。低設定と消耗品のコストで、この技術は安価です(約2米ドルサンプルあたり)、高スループット(複数の膜を同時に処理することができます)と短いターンアラウンドタイム(約10時間)があります。
手法はいくつかの方法で利用することができる。複数のプローブは、単一の増幅産物の中で配列変異を検出するように設計することができる、または複数の製品は、その後の検出に使用するもの(またはそれ以上)のプローブで、同時に増幅することができる。両方のアプローチの組み合わせは、単一のアッセイ内でも使用することができます。単一の標的配列に対して複数のプローブを含める機能は、アッセイの特異性の高いです。
mPCR / RLBの公開アプリケーションは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 3-5およびサルモネラ SP 6、 肺炎球菌 7,8、 連鎖球菌agalactiae 9およびエンテロウイルス10、11、識別の分子血清型別を入力し、抗生物質耐性遺伝子の1,2の検出を含むマイコバクテリウム属12、性器13-15および気道16と他の17病原体と検出とmollicutes 18の識別の検出。しかし、技術の汎用性は、アプリケーションが事実上無限と微生物の分子解析に限定されるものではないことを意味します。
mPCR / RLBの5つのステップは)プライマーとプローブの設計、b)のDNA抽出とPCR増幅C)膜の調製、d)のハイブリダイゼーションと検出であり、膜のe)の再生。
mPCR / RLB方法は、PCRアンプリコンの多数の同時検出を可能にする。ために化学発光プローブベースの検出の高感度で、プライマーペアの数が多い単一のマルチプレックスPCR反応はDNAテンプレートを増幅するために使用することができます。
は、プローブ信号が一つ以上のサンプルで得れていない場合は、残りのPCR産物をゲル電気泳動を行うと、問題はPCR増幅やプローブのハイブリダイゼーションになっているかどうかを区別することができます。膜上のすべてのプローブ信号が弱いか存在しないが、ゲル電気泳動が成功したPCR増幅を示す場所、可能性は膜の標識の問題、前使用後の膜の不正確な再生、ハイブリダイゼーションまたはストレプトアビジンのインキュベーション時に間違った温度、または不良品が含まれストレプトアビジンをペルオキシダーゼ結合体または検出試薬。
コントロールサンプルは、個々のプローブは偽陰性の信号を生成できることを示している場合は、ゲルベースの検出とそれに続くシーケンスを持つ単一のPCRは、PCR産物の増幅を確認するために、プローブ結合部位での配列変化を探すために実行することができます。弱いか存在しないプローブの信号は、大型アンプリコンの大きさに起因する可能性があります:可能であればすべてのアンプリコンは、同様の長さ未満の300bpのはずです。アンプリコンの二次的なDNA構造はまた、貧しい人々のプローブの結合が生じることがありますし、プライマーの再設計を必要になる場合があります。個々のプライマーまたはプローブ濃度は、信号強度を最適化するために変えることができる。
nonamplifiedプライマーやプライマーダイマーの生成物の結合プローブに起因する偽陽性シグナルは、ゲルベースの検出とそれに続くシークエンスで、単一のPCRを行うことにより調べることができます。この問題が発生した場合は、プローブの再設計を余儀なくされることがあります。プローブ結合部位の点変異が弱いか、または存在しない信号につながる可能性があります。各増幅産物のための2つのプローブを許可することで検出するためにこの簡単に行うことができます。この特性は、ターゲットDNAのわずかな配列の変化を検出するために慎重なプライマーとプローブの設計と悪用される可能性があります。
利用可能な製品の検出以下のマルチプレックスPCRの反応の多くのメソッドが存在する間は、要約すると、、mPCR / RLBは、高スループットと低設定、コストと安価であるという利点を持っています。メソッドの柔軟性は、幅広い用途にその使用を許可します。
The authors have nothing to disclose.
マシューオサリバンと飛洲は、オーストラリア国立保健医療研究審議会大学院医学研究奨学金の受取人です。
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
5′ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20×20 cm | PALL life sciences | 74480C | |
Deionised, purified water | |||
Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche | 11 089 153 001 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18×24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
Ice |
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Scientific | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
The Belly Dancer rocking platform | Stovall life science | Euro BDbo | |
Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
Water bath | |||
Suction | |||
Hot plate | |||
Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film |
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.