描述的是一种廉价的,同时检测到43个分子靶点的高通量方法。 MPCR / RLB的应用,包括微生物打字和多种病原体从临床标本的检测。
多重PCR /反向线杂交实验可以检测高达43在43个样品使用一个多重PCR反应探头上的尼龙膜,这是可重复使用的杂交分子靶点。探头5'胺修改,以允许固定膜。引物5'端生物素修改,允许使用的杂交,PCR链霉菌过氧化物酶和化学发光底物通过感光膜产品的检测。设置和低耗材成本,这种技术成本低廉(约每样本2美元),高吞吐量(可同时处理多个膜),有一个很短的周转时间(约10小时)。
该技术可以通过多种方式利用。设计多个探针,可在一个单一的扩增产物的序列变异检测,或多个产品可以被放大,同时,与一个(或多个)用于后续检测探头,。结合这两种方法也可以用来在一个单一的检测。包括一个单一的目标序列的多个探头的能力,使检测具有高度特异性。
MPCR / RLB发布的应用程序包括抗生素耐药性的基因1,2的检测,耐甲氧西林的金 黄色 葡萄球菌 3-5和沙门氏菌 SP 6,血清型的肺炎链球菌,无 乳链球菌 9 7,8和肠道病毒10,11,鉴定的分子打字分枝杆菌 ,检测生殖器13日至15日和 16和呼吸道等17个病原体检测和鉴定mollicutes 18 SP 12。然而,该技术的多功能性手段的应用几乎是无限的,而不是仅限于微生物的分子分析的。
MPCR / RLB的五个步骤a)引物和探针设计,B)DNA提取和PCR扩增C)膜的制备,D)杂交和检测,E)膜的再生。
MPCR / RLB方法,可同时检测大量的PCR扩增。由于高灵敏度的化学发光探针为基础的检测,一个单一的大量的引物对多重PCR反应,可用于放大DNA为模板。
如果没有探测信号与一个或多个样品,任何剩余的PCR产物进行凝胶电泳,获得可以帮助区分的问题是否与PCR扩增或探针杂交。膜的所有探头信号弱或缺席,但凝胶电泳显示PCR扩增成功,可能性包括膜标签的问题,膜后,以前使用的不正确的再生,在杂交或链霉亲和孵化不正确的温度,或有缺陷的链霉过氧化物酶结合物或检测试剂。
如果控制样本表明,个别探头可产生假阴性信号,单用凝胶为基础的检测和随后的测序PCR,可以进行验证的PCR产物的扩增和探针结合位点序列变异看。薄弱或者根本没有探头的信号,可能是由于大量扩增大小:所有的扩增产物,如果可能的话应该是类似的长度小于300 bp的。扩增产物中的DNA结构也可能产生探头约束力差,可能需要重新设计引物。个人引物或探针浓度也可能是多种多样的,以优化信号强度。
假由于探头nonamplified引物或引物二聚体产品具有约束力的积极信号,可以调查由执行单一的PCR扩增与凝胶检测和随后的测序。如果发生这种情况,重新设计的探头,可能是必要的。在探针结合位点的点突变可能会导致薄弱或者根本没有信号。允许每个扩增产物的两个探头,使得这种不易察觉的。可利用这一特点,小心的引物和探针的设计,检测目标DNA的小序列变异。
综上所述,虽然有许多产品检测以下多重PCR反应方法,MPCR / RLB低安装成本高吞吐量和廉价的优势。该方法的灵活性,允许其使用了广泛的应用。
The authors have nothing to disclose.
马修奥沙利文和周飞是澳大利亚国家卫生和医学研究理事会研究生医学研究奖学金的受助人。
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
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5′ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20×20 cm | PALL life sciences | 74480C | |
Deionised, purified water | |||
Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche | 11 089 153 001 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18×24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
Ice |
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
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Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Scientific | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
The Belly Dancer rocking platform | Stovall life science | Euro BDbo | |
Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
Water bath | |||
Suction | |||
Hot plate | |||
Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film |
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.