Een goedkope, high throughput methode voor gelijktijdige detectie van maximaal 43 moleculaire doelwitten wordt beschreven. Toepassingen van mPCR / RLB onder andere micro-organismen te typen en de detectie van meerdere pathogenen uit klinische monsters.
Multiplex PCR / Reverse Line Blot hybridisatie assay maakt de detectie van maximaal 43 moleculaire doelwitten in 43 monsters met behulp van een multiplex-PCR reactie, gevolgd door probe hybridisatie op een nylon membraan, dat is herbruikbaar. Sondes zijn 5 'amine aangepast om fixatie op het membraan mogelijk te maken. Primers zijn 5 'biotine gewijzigd, die de detectie van gehybridiseerde PCR-producten met behulp van streptavidine-peroxidase en een chemiluminescent substraat via lichtgevoelige film maakt. Met een lage instelling en verbruiksartikelen kosten, deze techniek is goedkoop (ongeveer US $ 2 per sample), high throughput (meerdere membranen kunnen gelijktijdig worden verwerkt) en heeft een korte doorlooptijd (ca. 10 uur).
De techniek kan worden gebruikt op een aantal manieren. Meerdere probes kunnen worden ontworpen om sequentievariatie detecteren binnen een geamplificeerd product of meerdere producten tegelijkertijd kunnen worden versterkt, met een (of meer) probes gebruikt voor de volgende detectie. Een combinatie van beide benaderingen kan ook gebruikt worden binnen een enkele assay. De mogelijkheid om meerdere sondes voor een enkele doelsequentie zijn maakt de test zeer specifiek.
Gepubliceerd op toepassingen van mPCR / RLB zijn detectie van antibiotica resistentie genen 1,2, typering van methicilline-resistente Staphylococcus aureus 3-5 en Salmonella sp 6, moleculaire serotypering van Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 en enterovirussen 10,11, identificatie van Mycobacterium sp 12, detectie van genitale 13-15 en luchtwegen 16 en 17 andere ziekteverwekkers en detectie en identificatie van mollicuten 18. Echter, de veelzijdigheid van de techniek betekent dat de toepassingen zijn vrijwel onbeperkt en niet beperkt tot moleculaire analyse van micro-organismen.
De vijf stappen in mPCR / RLB zijn a) Primer en Probe design, b), DNA-extractie en PCR-amplificatie c) Bereiding van het membraan, d) Hybridisatie en detectie, en e), regeneratie van het membraan.
De mPCR / RLB methode maakt gelijktijdige detectie van een groot aantal van de PCR-amplicons. Door de hoge gevoeligheid van chemiluminescent probe-gebaseerde detectie, kan een enkele multiplex-PCR reactie met grote aantallen primerparen worden gebruikt om de DNA-template te versterken.
Als er geen sonde signalen worden verkregen met een of meer monsters, het uitvoeren van gel elektroforese met de resterende PCR-product kan u helpen te onderscheiden of het probleem is met de PCR-amplificatie of probe hybridisatie. Waar alle probe signalen op het membraan zijn zwak of afwezig, maar gelelektroforese geeft aan een succesvolle PCR-amplificatie, mogelijkheden zijn problemen met de etikettering van het membraan, onjuiste regeneratie van het membraan na eerdere gebruik, onjuiste temperaturen tijdens de hybridisatie of streptavidine incubatie, of defecte streptavidine- peroxidaseconjugaat of detectie reagens.
Als controlemonsters aan te geven dat de individuele probes kunnen worden produceren van vals negatieve signalen, single PCR met gel-gebaseerde detectie en de daarop volgende volgorde kunnen worden uitgevoerd om versterking van het PCR-product te controleren en om voor sequentievariatie blik op de sonde bindingsplaats. Zwak of afwezig probe signaal kan te wijten zijn aan grote amplicongrootte: indien mogelijk, alle amplicons moeten ongeveer dezelfde lengte en minder dan 300 bp. Secundaire DNA-structuren van amplicons kunnen produceren ook een slechte sonde binding, en kan re-design van primers noodzakelijk. Individuele primer of probe concentraties kunnen ook worden gevarieerd om de signaalsterkte te optimaliseren.
Vals positieve signalen als gevolg van probe binding van nonamplified primers of primer-dimeer product kan worden onderzocht door het uitvoeren van een PCR met gel-gebaseerde detectie en de daaropvolgende sequencing. Als dit gebeurt, herontwerp van de probes kunnen worden noodzakelijk. Puntmutaties in probe bindingsplaatsen kan leiden tot zwak of afwezig zijn signalen. Het toestaan van twee sondes voor elk geamplificeerd product maakt dit gemakkelijk op te sporen. Deze eigenschap kan worden benut met een zorgvuldige primer en probe design tot kleine variaties in de volgorde target-DNA te detecteren.
Kortom, terwijl er vele methoden van detectie-product volgende multiplex PCR-reacties beschikbaar, mPCR / RLB heeft het voordeel dat high-throughput en goedkoop met lage setup-kosten. De flexibiliteit van de methode maakt het gebruik ervan in voor een breed scala aan toepassingen.
The authors have nothing to disclose.
Matthew O'Sullivan en Fei Zhou zijn de ontvangers van de Australische National Health en Medical Research Council Postgraduate Medical Research beurzen.
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
5′ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20×20 cm | PALL life sciences | 74480C | |
Deionised, purified water | |||
Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche | 11 089 153 001 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18×24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
Ice |
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Scientific | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
The Belly Dancer rocking platform | Stovall life science | Euro BDbo | |
Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
Water bath | |||
Suction | |||
Hot plate | |||
Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film |
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.