Eine preiswerte, einen hohen Durchsatz-Verfahren für die simultane Detektion von bis zu 43 molekulare Ziele beschrieben. Anwendungen der MPCR / RLB gehören mikrobielle Typisierung und Erkennung von mehreren Erregern aus klinischen Proben.
Multiplex PCR / Reverse Line-Blot-Hybridisierung Assay erlaubt den Nachweis von bis zu 43 molekularen Ziele in 43 Proben mit einer Multiplex-PCR-Reaktion durch Sondenhybridisierung auf eine Nylon-Membran, die wieder verwendbar ist, gefolgt. Die Sonden sind 5 'Amin modifiziert, um die Fixierung der Membran zu ermöglichen. Primer sind 5 'Biotin modifiziert denen der Nachweis der hybridisierten PCR-Produkte unter Verwendung von Streptavidin-Peroxidase und einem Chemilumineszenz-Substrat über lichtempfindliche Folie ermöglicht. Mit niedrigen Aufbau und die Kosten für Verbrauchsmaterialien, ist diese Technik kostengünstig (ca. US $ 2 pro Probe), einen hohen Durchsatz (mehrere Membranen können gleichzeitig verarbeitet werden) und hat eine kurze Turnaround-Zeit (ca. 10 Stunden).
Die Technik kann in eine Reihe von Möglichkeiten genutzt werden. Mehrere Sonden können zur Folge Variation innerhalb einer einzigen amplifizierten Produkts erkannt werden, oder mehrere Produkte gleichzeitig verstärkt werden, mit einem (oder mehreren) Sonden für die anschließende Detektion verwendet. Eine Kombination der beiden Ansätze können auch innerhalb eines einzigen Assay verwendet werden. Die Fähigkeit, mehrere Sonden für ein einzelnes Ziel-Sequenz enthalten ist der Test sehr spezifisch.
Veröffentlichte Anwendungen von MPCR / RLB umfassen die Detektion von Antibiotika-Resistenzgene 1,2, Typisierung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus 3-5 und Salmonella sp 6, molekulare Serotypisierung von Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 und Enteroviren 10,11, Identifikation von Mycobacterium sp 12, Erkennung von genitalen 13-15 und Atemwege 16 und 17 anderen Krankheitserregern und Detektion und Identifizierung von Mollicutes 18. Das bedeutet jedoch, die Vielseitigkeit der Technik der Anwendungen sind nahezu unbegrenzt und nicht auf molekulare Analyse von Mikro-Organismen beschränkt.
Die fünf Schritte in MPCR / RLB sind a) Primer und Probe-Design, b) DNA-Extraktion und PCR-Amplifikation c) Herstellung der Membran, d) Hybridisierung und Detektion, und e) Regeneration der Membran.
Die MPCR / RLB-Methode ermöglicht die gleichzeitige Erfassung einer großen Anzahl von PCR-Produkte. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Chemilumineszenz-Sonde-basierte Erkennung kann ein einzelner Multiplex-PCR-Reaktion mit einer großen Anzahl von Primerpaare verwendet, um die DNA-Template zu verstärken.
Wenn keine Sonde Signale mit einer oder mehreren Proben, die Durchführung Gelelektrophorese mit den verbliebenen PCR-Produkt erhalten werden können unterscheiden, ob das Problem mit PCR-Amplifikation oder Sondenhybridisierung ist. Wo alle Sonde Signale auf der Membran schwach oder nicht vorhanden sind, aber Gelelektrophorese zeigt die erfolgreiche PCR-Amplifikation unter anderem die Möglichkeiten Probleme mit Kennzeichnung der Membran, fehlerhafte Regeneration der Membran nach vorheriger Verwendung, fehlerhafte Temperaturen während der Hybridisierung oder Streptavidin Inkubation oder defekte Streptavidin- Peroxidase-Konjugat oder Nachweisreagenz.
Wenn Kontrollproben zeigen, dass die einzelnen Sonden können zu falsch negativen Signale, Einzel-PCR mit Gel-basierte Erkennung und anschließende Sequenzierung durchgeführt werden können, um die Amplifikation von PCR-Produkt zu überprüfen und für Sequenzvariation an der Sonde Bindungsstelle zu suchen. Schwache oder fehlende Sondensignal kann auf große Amplikon size: wenn möglich alle Amplikons sollten, die ähnlich lang und weniger als 300 bp sein. Secondary DNS-Strukturen von Amplikons können auch zu schlechten Sondenbindung und kann Re-Design der Primer erfordern. Individuelle Primer oder Sonden-Konzentrationen kann auch variiert werden, um die Signalstärke zu optimieren.
Falsch positive Signale aufgrund Sonde Bindung von nonamplified Primer oder Primer-Dimer-Produkt kann durch Ausführen einzelner PCR mit Gel-basierte Erkennung und anschließende Sequenzierung untersucht werden. Wenn dies geschieht, der Sonden Redesign kann erforderlich sein können. Punktmutationen in Sonde Bindungsstellen kann schwach oder nicht vorhanden Signalen führen. Zulassen von zwei Sonden für jedes amplifizierte Produkt macht dies leicht zu erkennen. Diese Eigenschaft kann bei sorgfältiger Primer und Sonde Design zu kleinen Sequenzvariationen in Ziel-DNA zu erkennen genutzt werden.
Kurzum, während es viele Methoden der Produkt-Erkennung folgenden Multiplex-PCR-Reaktionen zur Verfügung stehen, hat MPCR / RLB den Vorteil, dass High-Throughput-und kostengünstig mit geringem Setup-Kosten. Die Flexibilität der Methode erlaubt den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen.
The authors have nothing to disclose.
Matthew O'Sullivan und Fei Zhou sind Empfänger von Australian National Health and Medical Research Council Postgraduate Medical Research Stipendien.
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
5′ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20×20 cm | PALL life sciences | 74480C | |
Deionised, purified water | |||
Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche | 11 089 153 001 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18×24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
Ice |
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Scientific | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
The Belly Dancer rocking platform | Stovall life science | Euro BDbo | |
Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
Water bath | |||
Suction | |||
Hot plate | |||
Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film |
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.