Um barato, o método de elevada capacidade para detecção simultânea de até 43 alvos moleculares é descrito. Aplicações de mPCR / RLB incluem digitando microbiana e detecção de patógenos múltiplos a partir de amostras clínicas.
Multiplex PCR / Reverse Linha ensaio de hibridação Blot permite a detecção de até 43 alvos moleculares em 43 amostras, utilizando uma reação de PCR multiplex seguida de hibridização da sonda em uma membrana de nylon, que é reutilizável. Sondas são 5 'amina modificada para permitir a fixação à membrana. Primers são 5 'biotina modificados que permite a detecção de produtos hibridizados PCR usando estreptavidina-peroxidase e um substrato quimioluminescente via filme fotossensível. Com uma configuração baixa e custos de consumíveis, esta técnica é barata (cerca de EUA $ 2 por exemplo), alta taxa de transferência (membranas múltiplas podem ser processadas simultaneamente) e tem um tempo de resposta curto (cerca de 10 horas).
A técnica pode ser utilizada em um número de maneiras. Sondas múltiplas podem ser projetados para detectar variação da seqüência dentro de um único produto amplificado, ou vários produtos podem ser amplificados simultaneamente, com uma (ou mais) sondas utilizadas para a detecção subseqüente. A combinação das duas abordagens também podem ser usados dentro de um único ensaio. A capacidade de incluir sondas múltiplas para uma seqüência alvo único torna o ensaio altamente específico.
Publicado em aplicações de mPCR / RLB incluem a detecção de antibióticos 1,2 genes de resistência, a digitação de Staphylococcus aureus resistente à meticilina 3-5 e Salmonella sp 6, sorotipagem molecular de Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 e enterovírus 10,11, a identificação de Mycobacterium sp 12, detecção de 13-15 genital e do trato respiratório 16 e outros 17 agentes patogênicos e detecção e identificação de molicutes 18. No entanto, a versatilidade da técnica significa as aplicações são praticamente ilimitadas e não se restringe à análise molecular de microrganismos.
As cinco etapas em mPCR / RLB é um Primer) e design Probe, b) extração do DNA e amplificação c) Preparação da membrana, d) Hibridação e detecção e e) Regeneração da membrana.
O método mPCR / RLB permite a detecção simultânea de um grande número de amplicons PCR. Devido à alta sensibilidade de detecção da sonda baseada quimioluminescente, a única reação de PCR multiplex com grande número de pares de primers podem ser usados para amplificar o modelo de DNA.
Se não houver sinais de sonda são obtidos com uma ou mais amostras, realização de eletroforese em gel com qualquer produto PCR restantes podem ajudar a distinguir se o problema é com a amplificação ou a hibridização da sonda. Onde todos os sinais da sonda na membrana são fracos ou ausentes, mas indica eletroforese em gel de amplificação por PCR de sucesso, possibilidades incluem problemas com a rotulagem de membrana, a regeneração incorreta da membrana após o uso anterior, as temperaturas incorretas durante a incubação de hibridação ou estreptavidina, ou com defeito estreptavidina- conjugado peroxidase ou reagente de detecção.
Se as amostras de controle indicam que as sondas individuais podem estar produzindo falsos sinais negativos, a PCR simples com gel com base em seqüenciamento de detecção e subseqüente pode ser realizado para verificar a amplificação do produto de PCR e de olhar para a variação de seqüência no local da sonda de ligação. Sinal da sonda fraco ou ausente pode ser devido ao tamanho do amplicon grande: se possível todos os amplicons deve ser de comprimento similar e menos de 300 bp. Estruturas secundárias de DNA amplicons também pode produzir vinculativo sonda pobres, e pode necessitar de re-design de primers. Cartilha individuais ou concentrações de teste também pode ser variado para otimizar a força do sinal.
Falso-positivos devido à ligação dos primers sonda não amplificados ou primer dimer-produto pode ser investigado através da realização de PCR simples com gel com base em seqüenciamento de detecção e subsequente. Se isso ocorrer, o redesenho das sondas podem ser necessárias. Mutações pontuais em locais de ligação da sonda pode levar a sinais fracos ou ausentes. Permitindo duas sondas para cada produto amplificado torna isso fácil de detectar. Esta característica pode ser explorada com primer cuidadoso e design sonda para detectar variações na seqüência pequena do DNA alvo.
Em resumo, embora existam muitos métodos de detecção de produto seguintes reações multiplex PCR disponíveis, mPCR / RLB tem a vantagem de ser de alto rendimento e baixo custo de instalação com baixo-custo. A flexibilidade do método permite a sua utilização em uma ampla gama de aplicações.
The authors have nothing to disclose.
Mateus O'Sullivan e Fei Zhou são destinatários da Australian National Saúde e Pesquisa Médica do Conselho de Pós-Graduação Bolsas de Investigação Médica.
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
5′ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20×20 cm | PALL life sciences | 74480C | |
Deionised, purified water | |||
Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche | 11 089 153 001 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18×24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
Ice |
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Scientific | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
The Belly Dancer rocking platform | Stovall life science | Euro BDbo | |
Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
Water bath | |||
Suction | |||
Hot plate | |||
Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film |
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.