43 kadar moleküler hedeflere eş zamanlı olarak algılanması için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi açıklanmıştır. MPCR / RLB Uygulamaları mikrobiyal yazarak ve klinik örneklerde birden fazla patojenlerin tespiti içerir.
Multiplex PCR / Reverse Line Blot Hibridizasyon tahlil yeniden kullanılabilir bir naylon membran, prob hibridizasyon bir multipleks PCR reaksiyonu kullanılarak 43 örneklerinde 43 moleküler hedeflere kadar algılanmasını sağlar. Problar 5 'amin membran fiksasyonu sağlayacak şekilde değiştirilmiştir. Astarlar streptavidin-peroksidaz ve ışığa filmi üzerinden bir kemilüminesan substrat kullanarak melezleşmiş PCR ürünlerinin algılanmasını sağlar 5 'biotin değiştirilmiş. Düşük kurulum ve tüketim giderleri ile bu tekniği ucuz (yaklaşık US $ 2 örnek), yüksek verimlilik (aynı anda birden fazla membranlar işlenebilir) ve kısa bir geri dönüş süresi (yaklaşık 10 saat) sahiptir.
Bu teknik, bir kaç yolu kullanılabilir. Çoklu problar, tek bir amplifiye ürün içinde sıra varyasyonu tespit etmek için tasarlanmış olabilir, ya da sonraki tespiti için kullanılan bir (veya daha fazla) probları ile aynı anda birden fazla ürün yükseltilecek. Her iki yaklaşım da bir arada tek bir tahlil içinde de kullanılabilir. , Tek bir hedef sırası için birden fazla probları içerecek şekilde tahlil yeteneği son derece özel kılar.
Yayınlandı mPCR / RLB uygulamaları metisiline dirençli Staphylococcus aureus 3-5 ve Salmonella sp 6, moleküler, Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 ve enterovirüslerin 10,11, kimlik serotipleme yazmaya, antibiyotik direnç genleri 1,2 tespit Mycobacterium sp 12, 13-15 genital ve solunum yolu 16 ve diğer 17 patojenler ve algılama ve mollicutes 18 tanımlama tespit. Ancak, tekniğin çok yönlülük uygulamaların neredeyse sınırsız ve mikro-organizmaların moleküler analizi ile sınırlı değildir anlamına gelir.
MPCR / RLB beş adım a) Primer ve Prob tasarım, b) DNA ekstraksiyonu ve PCR c) membran hazırlanması, d) Hibridizasyon ve algılama, e) Membran Rejenerasyon.
MPCR / RLB yöntemi PCR amplikonlarının çok sayıda eş zamanlı algılama izin verir. Çünkü, kemilüminesan prob-bazlı saptama yüksek hassasiyet, çok sayıda primer çiftleri ile tek bir multipleks PCR reaksiyonu DNA örneğinin yükseltmek için kullanılabilir.
Prob sinyalleri kalan PCR ürünü ile jel elektroforezi gerçekleştirirken, bir veya daha fazla numune ile elde edilen PCR veya prob hibridizasyon sorunu olup olmadığını ayırt yardımcı olabilir. Membran tüm prob sinyalleri zayıf veya yok, ama jel elektroforezi başarılı PCR gösterir, olasılıklar membran etiketleme ile ilgili sorunlar, bir önceki kullanımdan sonra membran yanlış rejenerasyon, hibridizasyon veya streptavidin inkübasyon sırasında yanlış sıcaklıklarda, ya da kusurlu streptavidin peroksidaz konjuge veya algılama reaktif.
Kontrol örnekleri, bireysel probları yanlış negatif sinyaller, jel tabanlı algılama ve daha sonraki sıralama ile tek PCR PCR ürün amplifikasyon doğrulamak ve prob bağlama yerinde dizisi varyasyon bakmak için yapılabilir üreten olabileceğini göstermektedir. Zayıf ya da hiç prob sinyali geniş Amplikon boyutuna bağlı olabilir: Mümkünse tüm amplikonlarının benzer uzunluğu ve 300 bp den az olmalıdır. Amplikonlarının İkincil DNA yapılarını da kötü prob bağlama üretebilir ve astar yeniden tasarlamak gerekebilir. Bireysel primer veya prob konsantrasyonları da sinyal gücünü optimize etmek için farklı olabilir.
Nonamplified astarlar veya primer-dimer ürün bağlayıcı prob nedeniyle yanlış pozitif sinyaller tek PCR jel tabanlı algılama ve daha sonraki sıralama yaparak incelenmiştir. Bu durum oluşursa, gerekli olabilecek problar yeniden tasarımı. Prob bağlanma yerleri nokta mutasyonlarının, zayıf ya da hiç sinyal yol açabilir. Amplifiye her ürün için iki probları tespit etmek bu kadar kolay hale getirir. Bu özellik dikkatli astar ve prob tasarımı ile küçük hedef DNA dizisi değişimleri tespit etmek için yararlanılabilir.
Ürün algılama aşağıdaki multipleks PCR reaksiyonları pek çok yöntem varken Özetle, mPCR / RLB düşük kurulum maliyeti ile yüksek verimli ve ucuz olma avantajına sahiptir. Yöntemi esneklik, geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılmasına izin verir.
The authors have nothing to disclose.
Matthew O'Sullivan ve Fei Zhou Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Lisansüstü Tıbbi Araştırma Bursu alıcıları.
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
5′ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20×20 cm | PALL life sciences | 74480C | |
Deionised, purified water | |||
Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche | 11 089 153 001 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18×24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
Ice |
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Scientific | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
The Belly Dancer rocking platform | Stovall life science | Euro BDbo | |
Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
Water bath | |||
Suction | |||
Hot plate | |||
Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film |
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.