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Summary
간단한 슬롯 얼룩 방법은 생물 정보학 분석을 통해 확인된 그들의 가장 보존 시퀀스를 대상으로 보편적인 항체를 사용하여 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소과 neuraminidase의 부량 위해 개발되었습니다. 이 혁신적인 접근 방식은 모든 바이러스 적혈구응집소과 neuraminidase의 양적 결정에 유용한 대안을 제공할 수 있습니다.
Abstract
적혈구응집소 (HA)과 neuraminidase (NA)는 바이러스 생활주기 및 보호 면역 반응의 1,2의 유도에 중요한 역할을한다고 알려져 있습니다 인플루엔자 바이러스의 두 표면 단백질입니다. 중화 항체의 주요 대상으로, HA는 현재 인플루엔자 백신 힘 마커로 사용되며 하나의 방사상 immunodiffusion (SRID) 3로 측정됩니다. 그러나, 해당 subtype 특정 antisera의 예약 상황에 SRID의 의존은 모든 새로운 백신의 출시를 2-3 개월 지연 최소됩니다. 또한, NA는 또한 보호 면역 4, 인플루엔자 백신의 NA의 양에 따라 적절한 시약이나 분석 방법 5 부족으로 아직 표준화되지를 유도 증거에도 불구하고. 따라서, HA와 NA 항원을 quantifying 수있는 간단한 대체 방법은 빠른 출시 및 인플루엔자 백신의 더 나은 품질 관리를 위해 바람직합니다.
사용 가능한 모든 인플루엔자 HA와 NA 시퀀스에서 보편적으로 보존 지역은 6-7 생물 정보학 분석에 의해 확인되었습니다. 이 보존 시퀀스가 neuraminidases 한 효소 활성화된 사이트를 가까이 (HCA - 2로 지정)와에서 확인된 동안 하나의 시퀀스 (유니 - 1로 지정), HA, 융합 펩타이드 6만이 보편적으로 보존 에피토프에서 확인되었다 N - 말단 다른 클로즈 (HCA - 3으로 지정) 7. 이러한 아미노산 시퀀스와 펩티드가 합성과 항체 생산에 대한 토끼 면역에 사용되었습니다. HA의 유니 - 1 에피토프에 대한 항체는 HCA - 2 및 NA의 HCA - 3 지역에 대한 항체가 모든 9 NA의 subtypes를 바인딩 수있는 동안 인플루엔자 HA (H1 - H13) 13 subtypes에 바인딩할 수있었습니다. 모든 항체는 allantoic 단백질에는 교차 반응이 발견되지 않은 것을 관찰에 의해 입증 바이러스 시퀀스에 대한 놀라운 특이성을 보여주었다. 이러한 보편적인 항체 그런 다음 특정 antisera 7,8없이 인플루엔자 백신의 HA와 NA를 정할 슬롯 얼룩 assays을 개발하는 데 사용되었습니다. 백신 샘플은 다양한 농도로 희석 참조 표준과 함께 슬롯 얼룩 장치를 사용하여 PVDF 막에 적용되었습니다. HA의 감지, 샘플 및 표준은 먼저 희석되었다 트리스 버퍼 NA의 측정을 위해 그들이 이러한 조건으로 Zwittergent 0.01 %를 포함하는 TBS의 희석 동안 4M 요소를 포함하는 호수 (TBS)이 크게 검출 감도를 향상되었습니다. 각각의 보편적인 항체와 immunoblotting하여 HA와 NA의 항원의 검출에 따라 신호 강도가 densitometry로 계량되었습니다. 백신의 HA와 NA의 금액은 다음 사용하는 참조의 다양한 농도의 신호 강도와 설립 표준 곡선을 사용하여 계산되었다.
이러한 항체가 HA 또는 NA에서 유니버설 epitopes에 바인딩되는 감안할 때, 관심이 조사는 슬롯 얼룩 이외 immunoassays 연구 도구로 그들을 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. 시약 및 장비의 준비
- 슬롯 얼룩 절차를 시작하기 전에, 트리스 버퍼 호수 (20 MM 트리스, 137 MM NaCl, 산도 7.6) (TBS) 0.01 %의 적혈구응집소 또는 HA, 슬롯 얼룩, 또는 20_mls에 대한이 Zwittergent에서 4M 요소 솔루션의 20_mls 준비 neuraminidase에 대한 TBS, 또는 NA, 슬롯 얼룩의 솔루션입니다. 4M 요소가 항상 신선 준비를해야하지만, DH 2 O의 10 % Zwittergent 재고 솔루션은 실온에서 적어도 6 개월 동안 안정이므로 각 분석하기 전에 TBS에서 0.01 %로 희석 수 있습니다.
- 0.1 %의 최종 농도 TBS 솔루션 트윈 - 20을 추가하여 세척 버퍼 2000 MLS를 준비합니다. 버퍼를 세척에 W / V 5 % 최종 농도 탈지 우유 분말 (등급이 아닌 지방 건조 우유를 모래 바닥) 용해에 의해 차단 버퍼의 80 MLS를 준비합니다.
- ddH 2 O.에서 헹굼 2 분 뒤에 15 초간 메탄올의 PVDF 막 (9 X 12cm 크기로 미리 잘라) 활성화 사용까지 TBS에서 멤브레인를 적시게. TBS의 바이오 점 SF 필터 종이 사전 서부 유럽 표준시 3 매 사용까지.
2. 인플루엔자 백신 샘플 HA 슬롯 얼룩에 대한 참조 표준의 준비
테스트에 백신 변종에 해당하는 미리 정해진 HA 컨텐츠로 인플루엔자 예방 접종 참조 표준은 Biologics 평가와 연구 (CBER / FDA, 미국) 또는 생물 표준 및 제어를위한 국립 연구소 (NIBSC, 영국)의 센터에서 얻은하고 있었다 슬롯 얼룩에 의한 HA 부량 사용됩니다. 조사는 또한 참조 9 및 10에 설명된 설치 절차를 사용하여 자신의 항원 표준을 준비 수 있습니다.
- HA 참조 항원 및 테스트 백신 샘플 : 0, 0.0938, 0.1875, 0.375, 0.75, 1.5, 3, 6 μg의 HA / ML 다음 농도에 4M 요소 / TBS에서 HA 참조 항원 주식을 희석. 잘 섞는다. 그런 다음, 백신 생산에서 얻은 또는 4M 요소 / TBS의 과학 연구 목적으로 사내에서 만든 인간의 사용을위한 시험 백신 샘플을 희석하여 잘 섞는다. 참조 항원 및 백신 샘플을 중복 실행 될 수 있지만, triplicates이 선호됩니다. 샘플 농도가 표준 곡선 내에 떨어질 수 있도록 각 샘플 3 dilutions (2 배 차이)를 준비합니다. 각 참조 항원이나 중복을 실행하거나 각각 triplicates 테스트 백신 샘플 희석의 450 μl 650 μl 또는를 준비합니다. Monovalent 독감 백신이 슬롯 얼룩 방법으로 테스트할 수 있습니다. 참조 항원의 HA의 내용은 이전에 인플루엔자 백신 준비를 위해 현재 사용되는 표준 테스트입니다 SRID를 사용하여 결정되었다. SRID에 의해 결정 HA 내용은 슬롯 얼룩 표준 곡선에 대한 dilutions의 준비를 위해 초기 참조 항원 재고 HA 농도로 사용되었다.
3. NA 슬롯 얼룩에 대한 인플루엔자 예방 접종 샘플 및 참조 표준의 준비
테스트에 백신 변종에 해당하는 인플루엔자 예방 접종 참조 표준은 Biologics 평가와 연구 (CBER / FDA, 미국) 또는 생물 표준 및 제어 (NIBSC, 영국)의 국립 연구소에 대한 센터에서 얻은되었고 NA의 부량 사용됩니다 슬롯 얼룩에 의해. 이러한 참조 샘플 NA 내용이 densitometry 검사 분석과 함께 deglycosylated 샘플의 SDS - PAGE 분석에 의해 결정했고, 10 약간의 수정과 함께, 이전에 설명한 9. 간단히 deglycosylated 백신 참조 샘플 (5 μg)는 샘플 버퍼와 혼합되었고 겔에 로드된. 추적 염색 단지 Sypro의 얼룩 다음, 젤 빠질 때까지 겔은 약 90 분 20mA에서 실행되었다. 단백질의 Densitometry의 부량은 Fluorchem 겔 문서 시스템 (알파 Innotech)를 사용하여 실시되었다. NA의 금액으로 로리 분석에 의해 결정 총 단백질 NA 단백질의 비율에 따라 결정되었습니다. 이 방법을 사용하여 준비 참고 샘플은 다음 백신 제조 업체의 백신 샘플에서 NA 내용의 부량 슬롯에 얼룩에서 사용할 수 있습니다.
- NA 참조 항원 및 테스트 백신 샘플 : 0, 0.039, 0.078, 0.1562, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5 및 10 μg NA / ML : TBS / Zwittergent 다음과 농도에 0.01 %의 NA 참조 항원 주식을 희석. 잘 섞는다. 그런 다음, 백신 생산에서 얻은 또는 0.01 % Zwittergent / TBS의 과학 연구 목적으로 사내에서 만든 인간의 사용을위한 시험 백신 샘플을 희석하여 잘 섞는다. 참조 항원 및 백신 샘플을 중복 실행 될 수 있지만, triplicates이 선호됩니다. 샘플 농도가 표준 곡선 내에 떨어질 수 있도록 각 샘플 3 dilutions (2 배 차이)를 준비합니다. 각 참조 항원이나 중복을 실행하거나 각각 triplicates 테스트 백신 샘플 희석의 450 μl 650 μl 또는를 준비합니다. Monovalent 독감 백신은 재치를 테스트 할 수H이 슬롯 얼룩 방식입니다.
4. PVDF 막에 샘플 바이오 점 SF의 Microfiltration 장치와 모래 바닥의 조립
- 이전에 청소하고 건조 바이오 점 SF의 Microfiltration 장치를 조립. 진공 매니폴드에 개스킷 지원 플레이트를 삽입하고 3 가스켓을 통해 바이오 점 SF 필터 종이 시트를 moistened top.Place에 씰링 가스켓을 배치, 사전 절어 PVDF 막 다음. 멤브레인 표면에 압력을 균일 응용 프로그램을 보장하기 위해 대각선 횡단 패턴을 사용하여 멤브레인 및 손가락 조여 네 개의 나사 위에 샘플 템플릿을 놓습니다.
- 3 방향 밸브에만 펌프 켜기과 진공을 연결하기 전에 진공 소스에 진공 매니폴드를 노출하도록 설정되어 있는지 확인합니다.
- 펌프의 전원을 켜고 바이오 도트 장치에 연결합니다. 유량 조절 밸브는 다음 단계의 샘플의 신속하고 적절한 배수를위한 샘플 우물 아래 수준에 위치되어 있는지 확인합니다.
- 대각선 횡단 패턴을 사용하여 나사 강화 단계를 반복합니다. 진공이 적용되는 동안 나사를 강화하는 것은 어깨 도장을 확인하고 우물 사이의 교차 오염을 방지합니다.
- 공기 진공 매니폴드를 노출하고 펌프를 끌 수있는 유량 조절 밸브를 변경합니다.
- 따라서 항원의 균일한 바인딩을 확보 막을 rehydrate하는 다채널 pipettor을 사용하는 모든 우물에 TBS 100 μl을 적용합니다. 케어는 균일하게 슬롯을 커버하기 위해 거품의 형성을 방지하고 잘 한 가운데에있는 솔루션을 적용, 가능 한한 바닥에 가까이 이동합니다. 실수로 pipettor 팁 도입하는 공기 방울을 분사.
- , 공기와 진공 모두 다기관 노출 펌프 켜고, 그리고 부드럽게 진공의 양을 조절하는 공기에 노출되어있는 포트를 통해 손가락을 넣어 우물에서 버퍼를 유출하는 유량 조절 밸브를 변경합니다.
- 즉시 버퍼가 완전히 모든 우물에서 탈진 것처럼 공기에 연료를 노출 흐름 밸브를 변경합니다. 펌프를 끄고하거나 진공을 분리합니다.
- 잘마다 각각의 표준 또는 백신 샘플 희석 200 μl을 적용합니다. Pipet 샘플 각 우물의 중심에 한 번에 하나는, 같은 공기 방울을 도입 피하기 위해 간병, 가능한 한 아래로 닫습니다. 실수로 pipettor 팁 도입하는 공기 방울을 분사. 사용하고있는 우물에 적절한 진공을 보장하기 위해 사용되지 않는 우물의 샘플 희석 버퍼 (4M 요소 / TBS 또는 0.01 % Zwittergent / TBS) 200 μl를 넣어.
- 공기와 진공 모두 매니폴드를 노출하기 위해 유량 조절 밸브를 조정합니다. 펌프 (또는 진공을 다시 연결) 켜고 천천히 샘플 완전히 공기에 노출 포트를 통해 한 손가락과 진공의 양을 조절하여 우물에서 뺄 수 있습니다. 즉시 모든 샘플이 탈진 상태가로 진공을 해제하는 포트에서 손가락을 제거합니다.
- 즉시 잘 멀티채널 pipettor를 사용하여 각 TBS 200 μl를 추가합니다. 공기에 노출 포트를 통해 한 손가락과 진공의 양을 조절하여 우물을 배수하고 씻어 부드러운 진공을 적용합니다.
- 단계 4.11에 설명되어있는 세척 단계를 반복합니다. 우물이 완전히 말라있다 마자, 샘플 템플릿의 나사를 풀어 우물을 overdrying 피하기 위해 진공을 해제합니다. 즉시 멤브레인를 제거하는 진행합니다.
- 버퍼를 차단으로 막을 장소와 4 박 품어 ° C를 부드러운 락을 함께. 완전히 멤브레인을 감추기에 충분 할만큼 차단 버퍼를 사용합니다.
5. HA와 NA 항원의 Immunoblotting
- 차단 버퍼에 야간 부화 따라 TBS/0.1 % 트윈 - 20 세척 버퍼 5 분 동안 두 번 멤브레인 씻으십시오. 모든 세탁 및 incubations 들어, 멤브레인 완전히 솔루션으로 덮여 있는지 확인하십시오.
- 부드러운 함께 5 % 상온에서 한 시간 만이라도 버퍼를 세척에 W / V BSA에 희석 HA (예 : 유니 - 1) 또는 NA (예 : HCA - 2 또는 HCA - 3 등)에 대한 보편적인 토끼 항체와 세포막을 품어 락을. 최적의 항체 농도는 각 항체 주식 결정해야합니다. 토끼 방지 혈청 1:4000의 Dilutions은 위에서 언급한 항체에 대한 최적의 결과를 주었다.
- 모든 언바운드 차 항체를 제거하기 위해, 각 시간을 15 분 동안 부드러운 락을 함께 상온에서, 멤브레인 세 번 씻으십시오.
- HRP - 복합 백신 토끼 차 항체로 막을 품어. 써모 ImmunoPure 고앗 안티 - 토끼 IgG, 부드러운 락을 함께 30 분 동안 상온에서 버퍼와 부화를 차단에 퍼옥시데이즈 복합 항체의 1:50000 희석을 사용합니다.
- 모든 언바운드 차 항체를 제거하는 세척 버퍼가있는 방 온도에서 15 분 동안 매번 락을, 멤브레인 세 번 씻으십시오.
- 멤브레인 표면의 잔여 트윈 - 20 세제를 제거하는 부드러운 락을 5 분 동안 TBS와 멤브레인 씻으십시오.
- 각 R 3 ML과 기판 준비써모 과학 잘 혼합에서 Supersignal 웨스트 두라 연장 기간 기판 키트에서 eagent.
- 부드럽게 초과 TBS 버퍼를 제거하는 건조 티슈에 멤브레인 놓으십시오.
- 건조 용기에 멤브레인를 전송하고 전체 멤브레인을 커버하기 위해 기판을 추가합니다. 상온에서 부드러운 락을 5 분 알을 품다.
- 부드럽게 조직 용지에 막을 모래 바닥으로 여분의 기판을 제거합니다.
- chemiluminescence 영화에 멤브레인 노출. 노출의 길이는 신호 포화를 방지하는 것을 원칙으로하지만 보통 10 초에서 10 분 범위 것입 최적화해야합니다.
- 제조 업체의 지침에 따라 Fluorchem 겔 문서 시스템 (알파 Innotech) 같은 겔 이미징 장치를 사용하여 개발된 필름 densitometry 분석을 수행합니다. 참조 항원 및 테스트 백신 샘플 복제의 각 집합에 대한 밀도 값은 다음 평균입니다. 항원 표준과 백신 샘플 중복에서 실행할 수 있지만, triplicates이 선호됩니다. 복제에 대한 밀도 값은 매우 유사합니다. 사이의 중요한 차이는 절차를 수행하는 동안 상당한 기술적인 문제를 나타냅니다 복제합니다. 농도에 의존 표준 곡선은 HA 또는 참조 표준의 각 슬롯에 넣어 NA의 항원의 양을 (NG)를 대비 평균 밀도 값을 계획하고 설립합니다. immunoassays 적절한 보정 커브 피팅을 사용하면 정확 HA와 NA를 quantifying을 위해 중요합니다. 응답 곡선 (Y = MX + B)의 선형 부분을 사용하여 농도 (X) 대 응답 (Y)를하려 얻은 선형 회귀는 analytes의 부량위한 간단한 방법입니다. analytes의 넓은 범위 농도 계산으로 간주되면, 현재 접수 immunoassays에 대한 네 개의 매개 변수 물류 (4PL) 모델을 사용해야합니다. 소프트웨어의 다양한 고려에 관심이 조사에 사용할 수 있습니다. 설명 슬롯 얼룩 분석의 경우, X - 축 값을 규모를 로그 변환하면 커브가 HA와 NA의 blotted 금액을 계산하는 4 - PL 모델 및 변수 사면 비선형 회귀의 사용에 맞게 수 테스트 백신 샘플 따라서이 가능합니다. 따라서 일상적으로 우리가 분석을 위해이 모델을 사용합니다. 시험 백신 샘플 TBS / Zwittergent 전에 막에 blotted 것에 4M 요소 / TBS 또는 0.01 % 하나에 희석 것처럼, 각각의 샘플에 대한 희석 요소는 원본 시험의 HA와 NA의 내용을 확인하기 위해 고려되어야 백신 샘플. 이것은 각 테스트 백신 샘플이 표준 곡선 내에서 가을에 밀도 값 중 하나 세트 위해서는 세 가지 다른 dilutions (2 배 차이)에서 실행할 것을 권장합니다. 백신 샘플의 모든 테스트 dilutions에 대한 표준 곡선 범위보다 높은 밀도의 값은 정확하게 HA 또는 NA의 부량 대한 자세한 희석해야합니다. 밀도 값은 곡선의 가장 낮은 끝에 아래의 경우, 테스트 샘플은 낮은 희석 요소에 희석해야합니다.
6. 대표 결과 :
사용 가능한 모든 인플루엔자 HA 시퀀스의 생물 정보학 분석은 HA의 유일한 보존 지역으로 HA2 subunit (융합 펩타이드)의 N - 말단을 확인. 그림 1은 확인된 합의 시퀀스의 각 아미노산의 위치에 대한 보전 비율을 나타냅니다. 두 개의 유사 콘텐츠는 위치 2 (L -> I)과 HA2의 14 N - 터미널 아미노산 12 (G -> N)에 발견되었다지만, 그러한 변화는 항체와 펩타이드 변종 6 사이의 바인딩을 영향을 찾을 수 없습니다되었습니다 . 유니 - 1 에피토프 (GLFGAIAGFIEGGW)는 HA에 대한 보편적인 항체를 개발하기 위해 선정되었습니다. 이 항체는 바이러스 시퀀스에 대한 놀라운 특이성을 증명하고 독감 HA (H1 - H13) (그림 2)에 13 개의 다른 subtypes에 바인딩이 가능합니다.
비슷한 접근법을 사용, 두 보편적으로 보존 시퀀스는 모두 독감 NA이야, N - 터미 너스 (HCA - 3) 하나의 효소 활성 사이트 (HCA - 2)에 가까운 (그림 3A)와 다른 (그림 3B)에서 발견되었습니다 . 이러한 아미노산 시퀀스와 펩티드는 NA에 대한 보편적인 항체를 생성하는 항원으로 사용되었습니다. 두 epitopes에 대한 항체는 NA의 모든 구 subtypes에 바인딩 수 있었다 때문에 바이러스성 NA 시퀀스 (그림 4) 높은 특이성을 보여주는, allantoic 또는 세포 단백질을 거의 교차 반응을 보여주었다.
그림 5는 인플루엔자 HA와 NA의 부량에 대한 슬롯 얼룩 방법의 개요를 보여줍니다.
HA와 NA의 항원 슬롯 얼룩 분석의 예는 그림 6과 7에 표시됩니다. 그림 6A 및 독감 예방 접종 참조 표준 및 백신 샘플 각각의 HA 항원의 검출 후 6C 보여주는 대표적인 결과입니다. 각각의 샘플 (표준 또는 백신)이 인접 우물에서 중복에서 실행되었습니다. 중복 simila를 표시해야합니다검색 다음과 같은 R의 농도. 항체 dilutions, 부화 및 노출 시간의 최적화를 사용 항체에 따라 필요할 수 있습니다.
백신 참조 표준 샘플에서 HA의 다양한 농도의 감지 다음 얻은 전형적인 표준 곡선의 예제는 그림 6B에 표시됩니다. HA 항원의 농도는 슬롯 얼룩의 chemiluminescence 검출 다음과 같은 신호 강도에 비례하고 농도 범위 (0.0938-6 μg HA / ML)의 4 - PL 곡선 피팅 모델을 맞는 데요.
그림 7은 독감 예방 접종 참조 표준과 백신 샘플에서 NA의 항원의 검출을 대표하는 결과를 보여줍니다. 밀도 분석 슬롯 얼룩에 의해 백신 참조 표준의 다양한 dilutions의 NA의 항원을 감지하여 얻은 신호의 강도는 NA의 농도 (그림의 7A)에 비례 것으로 나타났다. 그 결과 표준 곡선은 그림 7B에 표시된이 농도 범위 (0.039-10 μg NA / ML)에 대한 4 - PL 모델을 맞는 데요. 7C 보여줍에게 독감 백신 샘플의 NA 내용의 슬롯 얼룩 분석의 예를 그림. 각 예제는 인접 우물에 중복으로 assayed되었다.
그림 1. 인플루엔자 HA의 융합 펩타이드 지역의 유니 - 1 에피토프의 보전 비율.
사용 가능한 모든 독감 융합 펩타이드는 (HA2 subunit의 N - 말단에 위치) HA의 유일한 보편적으로 보존 지역 확인 HA 시퀀스의 생물 정보학 분석. 두 위치 2 유사 (L -> I) 및 12 (G -> N이) 6 바인딩 항체에 영향을 찾을 수 없습니다라고합니다. 인플루엔자 HA (H1 - H13)의 구속력있는 13 개의 다른 subtypes 수있는 보편적인 항체는 유니 - 1 에피토프 (GLFGAIAGFIEGGW)를 사용하여 개발되었습니다.
그림 2. HA에 대한 보편적인 항체에 의해 HA 13 subtypes의 감지.
인플루엔자 바이러스 13 subtypes의 Allantoic 유체는 HA의 유니 - 1 에피토프에 대한 보편적인 항체를 사용하여 HA 단백질의 검출에 의해 다음, SDS - PAGE에서 fractionated되었습니다 embryonated 계란에 전파. NP 단백질은 polyclonal 토끼 NP 특정 항체를 사용하여 컨트롤을로드로 발견되었다. 대조군 (-)는 감염되지 않은 계란에서 allantoic 유체했다. 긍정적인 제어 (+) NIBSC, 영국에서 H1의 참조 표준되었습니다
그림 3. 인플루엔자 NA의 효소 활성 사이트와 N - 말단 근처의 순서 상동.
두 보편 보존 시퀀스는 인플루엔자 NA의 생물 정보학에 의해 효소 활성 사이트 (HCA - 2) 근처에 위치한 하나 (패널 A), N - 터미 너스 (HCA - 3) (패널 B)의 다른 발견되었습니다. 이러한 보존 아미노산 시퀀스와 펩티드가 합성 및 NA에 대한 보편적인 항체를 생성하는 데 사용되었습니다.
그림 4. NA 항체에 의해 NA 9 subtypes의 감지.
인플루엔자 바이러스 아홉 NA의 subtypes의 Allantoic 유체는 HCA - 2 (패널 A)와 HCA - 3 (패널 B) 항체를 사용하여 NA 단백질의 검출에 의해 다음, SDS - PAGE에서 fractionated되었습니다 embryonated 계란에 전파. NP 단백질은 토끼 polyclonal NP 특정 항체 (패널 C)를 사용하여 컨트롤을로드로 발견되었다. 대조군 (-)는 감염되지 않은 계란에서 allantoic 유체했다. 긍정적인 제어 (+) / 뉴 Caledonia/20/99의 rNA1를 타서 allantoic 유체되었으며 해당 antisera로 탐지.
그림 5. 인플루엔자 백신의 HA와 NA 항원의 quantitation를위한 슬롯 얼룩 절차의 플로우 차트.
같은 슬롯 얼룩 막 닦고 차단뿐만 샘플 희석에 필요한 버퍼가 먼저 준비와 PVDF 막과 바이오 점 SF의 microfiltration 장치의 조립에 필요한 필터 서류는 사전에 절어입니다. 인플루엔자 백신 및 참조 표준 샘플은 HA 또는 슬롯 얼룩에 의해 NA 감지에 대한 최적의 버퍼에 희석하고 있습니다. 바이오 점 SF의 microfiltration 장치는 제조 업체의 지침과 샘플 PVDF 막에 적용에 따라 조립합니다. HA와 NA의 항원은 각 항원에 대한 보편적인 항체를 사용하여 감지됩니다. Densitometry 분석은 테스트 샘플의 HA와 NA의 quantitation에 대해 얻은 chemiluminescence 신호에서 수행됩니다.
그림 6. 인플루엔자 백신 샘플에서 HA 항원의 검색 및 참조표준 줬어.
패널은 HA의 항원의 면역 다음 얻은 대표적인 얼룩을 보여줍니다. HA 참조 항원은 HA / ML 및 백신이 바이오 - 도트 SF의 microfiltration 장치와 PVDF 막에 적용되기 전에 4M 요소 / TBS에서 0.375 μg HA / ML의 농도로 희석되었다 0-6 μg의 농도로 희석되었다 . HA의 항원은 다음 유니 - 1 범용 항체를 사용하여 검색했습니다. 패널 B는 백신 참조 표준의 다양한 HA의 농도의 신호를 감지하여 얻은 표준 곡선의 예를 보여줍니다. 신호 강도는 HA의 농도에 비례하고 곡선은 4 - PL 모델을 맞는 데요.
그림 7. 인플루엔자 백신 샘플 및 참조 표준 NA의 항원을 감지.
패널 A와 B 쇼 관계자는 0.01 % Zwittergent / TBS와 densitometry 분석 다음과 같은 결과 4 PL 표준 곡선에 0부터 10 μg NA / ML에 이르기까지 NA의 농도로 희석 독감 예방 접종 참조 표준의 NA의 검출 다음 얻은 신호. 독감 예방 접종 샘플에서 NA의 항원의 슬롯 얼룩 분석 다음 검색 전형적인 chemiluminescence 신호의 예제는 0.01 % Zwittergent / TBS 1 μg HA / ML의 농도로 희석되었다 패널 C. 인플루엔자 백신 샘플로 표시되며로 blotted되었습니다 PVDF 막는 바이오 - 도트 SF의 microfiltration 장치를 사용하여. 0에서 2.5 μg NA / ML까지 농도와 해당 백신 참조 표준의 Dilutions는 백신 샘플에서 NA의 항원의 quantitation에 대한 표준 곡선을 형성하기 위해 같은 얼룩에 포함되었습니다. NA의 항원은 NA와 수행된 얻은 chemiluminescence 신호의 densitometry 분석에 대한 HCA - 2 보편적인 항체로 검출되었다. 각 백신 샘플 NA의 금액은 백신 참조 표준에 대한 NA 농도 대 신호 강도 값을하려하고 얻은 4 PL 표준 곡선으로부터 계산하실 수 있습니다.
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Discussion
이 두 표면 단백질은 면역 반응을 유도 6-11에게 가장 중요한 요소이기 때문에 바이러스 인플루엔자 바이러스는 HA와 NA의 양적 결정은 백신 연구 및 개발을 위해 중요하다. 이러한 단백질의 검출 이전에 보고된 면역 방법은 스트레인 특정 항체를 필요로합니다. 항체가 자신의 유일한 보편적으로 보존 epitopes 6-8을 인식 때문에 HA와 NA 항원 여기에 설명된 내용을 계량하는 간단 재현성과 빠른 슬롯 얼룩 방법은 모든 독감 바이러스는 HA와 NA 단백질에 적합합니다. 이 방법에 관심이 조사에 대한 유일한 어려움들은 사내에 그러한 보편 항체가 없다는 것을 수 있습니다. 그러나, 항원으로 펩티드를 사용하여 이러한 항체의 생성은 일상적인 절차입니다. 변종의 펩티드가 경쟁력 엘리사 6-8에 주어진 펩타이드에 바인딩을 위해 서로 동일하게 경쟁하기 때문에 관심있는 과학자들이 설명되어있는 절차에 따라 항체 자신을 만들 수 있지만, 그들은 또한되도록 HA와 NA의 항체에 대한 저자에게 문의하실 수 있습니다 그들의 탐험 연구에 사용됩니다.
까지 슬롯 얼룩 분석에 관한 한, 그것은 위에서 설명한 바와 같이, 단 몇 걸음에 필요한 특별한 관심과 함께 오히려 간단합니다. HA와 NA가 모두 치료 샘플에 포착할 수 있지만, 증가 감도는 샘플의 전처리에 의해 달성되었다.
단순, 인텔리 및 재현성 자신의 장점에도 불구하고, 여기에서 설명한 범용 항체 기반 슬롯 얼룩 방법은 특정 제한이 있습니다. 예를 들면, 그들은 다른 HA 또는 NA의 subtypes을 구분하도록 설계되지 않은 다음과 같은, 품질 관리 프로세스 및 / 또는 monovalent 백신 준비 분석에 대한 가능성이 더 적합합니다. SRID 검정 따라서 인플루엔자 백신 3 바이러스 HA의 subtypes을 식별하는 선택의 방법 남아 있습니다.
즉, HA와 NA의 높은 보존 시퀀스는 인플루엔자 바이러스 HA와 NA의 거의 모든 변종의 양적 분석에 대한 고용 수있는 모노 특정 항체를 생성하기 위해 선택되었습니다. HA와 NA에 대한 이러한 보편적인 항체와 함께 자세한 슬롯 얼룩 절차가 여기에 제시되는 동안 관심이 조사관들은 allantoic와 교차 반응 감지 않고도 바이러스 시퀀스에 대한 놀라운 특이성을 보여주는 것을 감안할 때, 면역 분석법의 다른 유형의 기본적인 연구 도구로 그들을 사용할 수 또는 세포 단백질. 또한 지폐는 HA에 대한 보편적인 항체가 기본적인 연구 도구로 이러한 항체의 응용 프로그램의 광범위한 범위를 강조 바이러스에 감염된 세포 문화 12의 기본 형태에 HA를 감지할 수있다는 것입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 원고의 광고 문안 검토를 위해 부인 모니카 Tocchi 감사하고 싶습니다. AMH가 캐나다에서 사우디 아라비아 문화 협회를 통해 킹 Abdulaziz 대학에서 장학금으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus | Bio-Rad | 170-6542 | |
| Bio-Dot SF Filter paper | Bio-Rad | 162-0161 | |
| Immobilon-FL transfer membrane (PVDF) | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| Vacuum pump | EMD Millipore | WP6111560 | |
| Chemiluminescence BioMax Light Film | Kodak | 178 8207 | |
| FluorChem Gel Documentation System | Alpha Innotech | 29-008-1896X | |
| Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens | Uni-1 (HA)HCA-2, HCA-3 (NA) | Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7. | |
| Influenza vaccine reference antigen | CBER/FDA or NIBSC | ||
| Influenza vaccine samples | Commonly available in most countries | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | |
| Zwittergent 3-14 Detergent | Calbiochem | 693017 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 31460 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 34075 |
References
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면역학 제 50 바이러스학 인플루엔자 적혈구응집소 neuraminidase 부량 유니버설 항체Erratum
Formal Correction: Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays
Posted by JoVE Editors on 11/13/2012.
Citeable Link.
An author's affiliation was omitted from the publication of Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. A third affiliation was added for Anwar M. Hashem:
Microbiology Department, Faculty of Medicine, King Abdulaziz University
