ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
En korunmuş dizileri biyoinformatik analizleri ile tespit hedefleyen evrensel bir antikor kullanarak influenza virüs hemaglutinin ve nöraminidaz miktarının tayini için basit bir yuva blot yöntemi geliştirilmiştir. Bu yenilikçi yaklaşım, tüm viral hemaglutinin ve nöraminidaz kantitatif tayini için kullanışlı bir alternatif sunabilir.
Abstract
Hemaglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA), viral bir yaşam döngüsü ve koruyucu immün yanıtları 1,2 indüksiyonu önemli rol oynadığı bilinmektedir grip virüsleri iki yüzey proteinleri. HA nötralize edici antikorlar için ana hedef olarak, şu anda grip aşısı potens belirteci olarak kullanılır ve tek radyal immunodiffüzyon (SRID) 3 ile ölçülür . Ancak, ilgili alt tip spesifik antiserumlar durumu SRID bağımlılığı her yeni aşı serbest bırakılması için en az 2-3 ay gecikme neden olur. Ayrıca, NA da, koruyucu bağışıklığı 4, influenza aşılarının NA miktarını uygun reaktifler analitik yöntem 5 eksikliği nedeniyle henüz standart değil uyardığı kanıtlara rağmen . Böylece, HA ve NA antijenleri nicel kapasitesine sahip basit bir alternatif yöntemler hızlı serbest bırakılması ve influenza aşıları daha iyi kalite kontrol için arzu edilir.
Mevcut tüm influenza A HA ve NA dizileri Evrensel korunmuş bölgelerde 6-7 biyoinformatik analizleri ile tespit edilmiştir. Bir dizisi (Uni-1 olarak belirlenen), iki korunmuş dizileri, enzimatik aktif sitesine yakın (HCA-2 olarak belirlenmiş) ve nöraminidaz tespit ise, füzyon peptid 6 HA, sadece evrensel korunmuş epitop tespit edildi N-terminalindeki diğer yakın (HCA-3 olarak belirlenmiş) 7. Bu amino asit dizileri ile Peptitler sentezlenen ve antikor üretimi için tavşan bağışıklık kullanılır. HA Uni-1 epitop karşı antikor HCA-2 ve HCA-3 bölge (NA) karşı antikorlar 9 NA alt tipi bağlama kapasitesine sahip iken 13 alt tipi influenza A HA (H1-H13) bağlamak mümkün oldu. Tüm antikorlar allantoik proteinlere karşı çapraz reaktivite tespit edildiğini gözlem kanıtladığı gibi viral dizileri karşı olağanüstü özgüllük gösterdi. Bu evrensel antikorlar daha sonra spesifik antiserumlar 7,8 gerek kalmadan aşılar influenza A HA ve NA ölçmek için slot blot testleri geliştirmek için kullanılmıştır. Aşı örnekleri çeşitli konsantrasyonlarda seyreltilmiş referans standartları ile birlikte bir yuva leke aparatı kullanarak PVDF membran üzerine uygulandı. HA tespiti için, örnekler ve standart ilk seyreltilmiş edildi Tris tamponlu salin (TBS), NA ölçümü için% 0,01 olarak Zwittergent bu koşulları içeren TBS seyreltilmiş iken 4M üre içeren algılama hassasiyetini önemli ölçüde geliştirilmiş. HA ve NA antijenleri kendi evrensel antikorlar ile immün tespiti sonrasında, sinyal intensitesi dansitometrisi tarafından ölçüldü. HA ve NA aşıların miktarları daha sonra çeşitli konsantrasyonlarda kullanılan referanslar sinyal intensitesi ile kurulmuş bir standart eğrisi kullanılarak hesaplanmıştır.
Bu antikorların, HA ve NA evrensel epitoplar bağlamak göz önüne alındığında, ilgilenen araştırmacılar sadece slot leke dışında immunoassay araştırma araçları olarak kullanabilirsiniz.
Protocol
1. Reaktifler ve ekipmanların hazırlanması
- Yuvası leke işlemine başlamadan önce, Tris-tamponlu salin (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7.6) (TBS)% 0.01 hemaglutinin HA, yuva leke, ya da 20_mls Zwittergent 4M üre çözeltisi 20_mls hazırlamak TBS, nöraminidaz veya NA, yuvası leke çözüm. 4M üre her zaman taze olarak hazırlanması gerekir iken,% 10 Zwittergent dH 2 O bir stok solüsyonu oda sıcaklığında en az 6 ay için kararlı ve bu nedenle her bir deney önce TBS içinde% 0.01 seyreltilmiş olabilir.
- TBS çözüm nihai konsantrasyonu% 0.1 Tween-20 ekleyerek 2000 ml yıkama tamponu hazırlayın. Engelleme tampon 80 ml yağsız süt tozu (dereceli yağsız kuru süt blot) tampon yıkama son konsantrasyonu% 5 w / v eriterek hazırlayın.
- GKD 2 O. durulama ardından 2 dakika 15 saniye boyunca metanol PVDF membran (9 x 12 cm boyutlarında, pre-cut), aktive TBS içinde membran kullanana kadar bekletin. TBS Bio-Nokta SF filtre kağıdı Öncesi ıslak 3 sayfa kadar.
2. Influenza aşısı örnekleri ve HA yuvası leke için referans standart hazırlanması
Grip aşısı referans standartları test edilecek aşı suşları karşılık gelen önceden belirlenmiş HA içeriği ile Merkezi Biyolojik Değerlendirme ve Araştırma (CBER / FDA, ABD) ya da Ulusal Biyolojik Standart ve Kontrol Enstitüsü (NIBSC UK) için elde edilen ve HA yuvası leke ölçümü için kullanılır. Araştırmacılar ayrıca, 9 ve 10 referans açıklandığı gibi kurulmuş prosedürlerini kullanarak kendi antijen standartları hazırlayabilir.
- HA referans antijen ve test aşı örnekleri için: 0, 0,0938, 0,1875, 0.375, 0.75, 1.5, 3 ve 6 mikrogram HA / ml: Aşağıdaki konsantrasyonlarda 4M üre / TBS HA referans antijen stok sulandırınız. İyice karıştırın. Daha sonra, aşı üreticilerine elde edilen ya da 4M üre / TBS, bilimsel araştırma amaçlı ev yapılan beşeri test aşı örnekleri sulandırmak ve iyice karıştırın. Referans antijen ve aşı örnekleri çiftleri çalıştırmak mümkün olmakla birlikte, triplicates tercih edilmektedir. Örnek konsantrasyonu standart eğri içinde düşmesine izin için her numunenin 3 dilüsyonları (2 kat fark) hazırlayın. Her referans antijen testi aşı dilusyonun çiftleri çalıştırmak veya sırasıyla triplicates 450 veya 650 ul ul hazırlayın. Monovalan İnfluenza A aşıları bu yuvası blot yöntemi ile test edilebilir. Referans antijenlerin HA içeriği daha önce grip aşısı hazırlıkları için şu anda kullanılan standart test SRID kullanarak tespit edildi. SRID tarafından belirlenen HA içerik yuvası leke standart eğri dilüsyonlarının hazırlanması için ilk referans antijen stok HA konsantrasyonu olarak kullanılmıştır.
3. NA yuvası leke için grip aşısı örnekleri ve referans standart hazırlanması
Grip aşısı test edilecek aşı suşları karşılık gelen referans standartları Merkezi Biyolojik Değerlendirme ve Araştırma (CBER / FDA, ABD) ya da Ulusal Enstitüsü Biyolojik Standart ve Kontrol (NIBSC UK) için elde edilmiştir ve NA ölçümü için kullanılan yuvası leke. Bu referans örneklerin NA içeriği densitometrisi analizi ile birlikte deglycosylated örneklerin SDS-PAGE analizi ile tespit edildi, 10 hafif değişiklikler, daha önce 9 tarif. Kısacası, deglycosylated aşı referans örnekleri (5 mg) örnek tamponu ile karıştırıldı ve jel üzerinde yüklenen. Jel sadece izleme boya SYPRO boyama, jel tükendi kadar yaklaşık 90 dakika için 20 mA çalıştırıldı. Proteinlerin Dansitometrisi kantifikasyon Fluorchem jel dokümantasyon sistemi (Alpha Innotech) kullanılarak gerçekleştirildi. Miktar NA NA proteinleri Lowry yöntemi ile belirlenen toplam proteinlerine oranına göre belirlenir. Daha sonra bu yöntem kullanılarak hazırlanan Referans örnekleri yuvası leke aşılar üreticileri aşı örneklerinde NA içeriğinin ölçümü için kullanılabilir.
- NA referans antijen ve test aşı örnekleri için:% 0.01, 0, 0.039, 0.078, 0,1562, 0,3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5 ve 10 mg NA / ml: TBS / Zwittergent aşağıdaki konsantrasyonlarda NA referans antijen stok seyreltilir. İyice karıştırın. Daha sonra, aşı üreticilerine elde edilen veya% 0.01 Zwittergent / TBS, bilimsel araştırma amaçlı ev yapılan beşeri test aşı örnekleri sulandırmak ve iyice karıştırın. Referans antijen ve aşı örnekleri çiftleri çalıştırmak mümkün olmakla birlikte, triplicates tercih edilmektedir. Örnek konsantrasyonu standart eğri içinde düşmesine izin için her numunenin 3 dilüsyonları (2 kat fark) hazırlayın. Her referans antijen testi aşı dilusyonun çiftleri çalıştırmak veya sırasıyla triplicates 450 veya 650 ul ul hazırlayın. Monovalan influenza A aşı zekâ test edilebilirh Bu yuvaya blot yöntemi.
4. Meclis PVDF membran örneklerin Bio Nokta SF Mikrofiltrasyon aparatı ve blot
- Daha önceden temizlenmiş ve kurutulmuş Bio-Dot SF Mikrofiltrasyon aparat birleştirin. Vakum manifoldunun içine yerleştirin ve conta destek plakası, 3 yaprak conta üzerinde Bio-Dot SF filtre kağıdı nemlendirilmiş top.Place conta yere önceden ıslatılmış PVDF membran ile izledi. Membran ve membran yüzey üzerinde baskı yeknesak uygulanmasını sağlamak için bir çapraz geçiş paterni kullanarak parmak sıkın dört vidayı üstüne örnek şablonu yerleştirin.
- 3-yollu vana, pompa açma ve vakum bağlamadan önce sadece vakum manifoldu vakum kaynağına maruz ayarlanmış olduğundan emin olun.
- Pompa açın ve Bio-Dot cihazları bağlamak. Akış valfi numunelerin hızlı ve uygun bir drenaj için aşağıdaki adımları örnek kuyu altında bir seviyede yerleştirilmiş olduğundan emin olun.
- Çapraz geçiş desen kullanarak vida sıkma adımı tekrarlayın. Vakum uygulanır iken vida sıkma, sıkı bir izolasyon sağlar ve kuyular arasındaki çapraz kirlenmesini önler.
- Hava vakum manifoldu ortaya çıkarmak ve pompa kapatmak için akış valfi değiştirin.
- TBS 100 ul böylece antijen yeknesak bağlama sağlayan membran rehidrate çok kanallı pipet kullanarak tüm kuyulara uygulayın. Bakım eşit yuvası kapağını amacıyla, kabarcık oluşumunu önlemek ve iyi orta çözümü uygulamak için, mümkün olduğunca dibe yakın olmalıdır. Yanlışlıkla bir pipet ucu ile tanıtılan herhangi bir hava balonu patladı.
- Akış valfi, hava ve vakum manifoldu maruz pompa açmak ve vakum miktarını düzenlemek için havaya maruz bağlantı noktası üzerinden bir parmak koyarak hafifçe kuyulardan tampon drenaj değiştirin.
- Tampon tamamen kuyulardan süzülmüş gibi kısa sürede hava manifoldu maruz akış valfi değiştirin. Pompa kapatın veya vakum bağlantısını kesin.
- De başına her bir standart veya aşı dilusyonun 200 ul uygulayın. Pipetleyin örnekleri her bir kuyunun ortasında bir defada biri, hava kabarcıkları almaktan kaçınması dikkat ederek, mümkün olduğu kadar alt yakın. Yanlışlıkla bir pipet ucu ile tanıtılan herhangi bir hava balonu patladı. Kuyuların kullanım için uygun vakum sağlamak için kullanılmayan kuyu örnek seyreltme tamponu (4M üre / TBS veya% 0.01 Zwittergent / TBS) 200 ul koyun.
- Akış valfi, hava ve vakum manifoldu maruz ayarlayın. Pompa (veya vakum yeniden) açın ve yavaşça örnekleri tamamen havaya maruz bağlantı noktası üzerinden bir parmak ile vakum miktarını kontrol ederek kuyulardan dışarı akmasını sağlar. Kısa sürede tüm örnekleri drene olduğu gibi vakum serbest liman parmak kaldırın.
- Hemen her biri de çok kanallı pipet kullanarak 200 ul TBS'nin ekleyin. Boşaltma ve havaya maruz bağlantı noktası üzerinden bir parmak ile vakum miktarını kontrol ederek kuyu yıkamak için yumuşak bir vakum uygulayın.
- Yıkama adım adım 4.11 açıklanan tekrarlayın. Kuyu tamamen drene olan en kısa sürede, örnek şablon vidaları gevşetin ve kuyular saçınızın aşırı kurumasını önlemek için vakum kapatın. Membran hemen kaldırmak için devam edin.
- Membran tampon engelleme içine yerleştirin ve 4 gece boyunca inkübe ° C, nazik sallanan. Membran tamamen karşılamak için yeterli engelleme tampon kullanın.
5. HA ve NA antijenler, İmmünoblotting
- Engelleme tampon gecelik inkübasyon sonrasında, TBS/0.1% Tween-20 yıkama tamponu ile membran iki kez 5 dakika boyunca yıkayın. Tüm yıkamalar ve inkubasyon, membran tamamen çözüm kaplıdır sağlamak.
- Nazik,% 5 w / v BSA oda sıcaklığında bir saat boyunca tampon yıkama seyreltilmiş HA (Uni-1) ve NA (HCA-2 veya HCA-3 gibi) karşı evrensel bir tavşan antikoru ile membran inkübe sallanan. Optimal antikor konsantrasyonları her antikor hisse senedi için tespit edilmesi gerekmektedir. Tavşan anti-serum, 1:4000 çözeltiler yukarıda belirtilen antikorları için optimum sonuçlar verdi.
- Bağlanmamış birincil antikor kaldırmak için, her seferinde 15 dakika boyunca hafif sallanan ile oda sıcaklığında, membran üç kez yıkayın.
- Membran HRP-konjuge anti-tavşan ikincil antikor ile inkübe edin. Thermo ImmunoPure Keçi anti-tavşan IgG, nazik sallanan ile 30 dakika oda sıcaklığında inkübe tampon ve engelleme peroksidaz konjuge antikor 1:50000 seyreltme kullanın.
- Bağlanmamış sekonder antikor çıkarmak için yıkama tamponu ile oda sıcaklığında, 15 dakika için her zaman sallanan, membran üç kez yıkayın.
- TBS ile membran, membran yüzeyinde kalan Tween-20 deterjan kaldırmak için nazik sallanan ile 5 dakika yıkayın.
- Her r 3 ml yüzey hazırlayınThermo Scientific ve iyice karıştırın Supersignal Batı Dura Uzun Süre Yüzey kiti eagent.
- Herhangi bir aşırı TBS tampon hafifçe kaldırmak için, kuru bir kağıt mendil membran yerleştirin.
- Kuru bir kaba aktarın ve membran tüm membran kapak yüzey ekleyin. Oda sıcaklığında, yumuşak sallanan ile 5 dakika inkübe edin.
- Kağıt mendil hafifçe membran blot fazla substrat çıkarın.
- Kemilüminesans film membran Açığa. Maruz kalma süresini sinyal doygunluğunu önlemek için ancak genellikle 10 saniye ile 10 dakika arasında değişmektedir optimize edilmesi gerekecektir.
- Üreticinin talimatları izleyerek Fluorchem jel dokümantasyon sistemi (Alpha Innotech) gibi bir jel görüntüleme cihazı kullanarak gelişmiş film dansitometrisi analizler gerçekleştirin. Referans antijen ve test aşı örnekleri çoğaltır her set için yoğunluk değerleri ortalaması alınır. Antijen standartları ve aşı örnekleri çiftleri çalıştırmak olabilir, triplicates tercih edilmektedir. Çoğaltır için yoğunluk değerleri birbirine çok benzer olmalıdır. Arasında önemli farklılıklar işlem sırasında olası bir teknik soruna işaret ediyor çoğaltır. Konsantrasyon bağımlı bir standart eğri ortalama yoğunluk değerleri HA ya da referans standart, her bir yuvaya koymak NA antijen miktarı (ng) karşı komplo tarafından kurulmuştur. Immunoassay uygun kalibrasyon eğri uydurma, doğru bir şekilde HA ve NA ölçülmesi için kritik öneme sahiptir. Yanıt eğrisi (y = mx + b) doğrusal bir kısmını kullanarak konsantrasyonu (x) (y) karşı tepki çizilmesi ile elde edilen lineer regresyon, analitlerin ölçümü için en basit yöntemdir . Analitlerin konsantrasyon hesaplanması için daha geniş bir kabul edilirse, şu anda kabul immunoassay için dört parametre lojistik (4PL) modeli kullanılmalıdır. Ilgilenen araştırmacılar için dikkate alınması gereken bir çok yazılım mevcuttur. Açıklanan yuvası blot assay durumda, x-ekseni değerleri ölçekli oturum dönüştürme eğrisi HA ve NA, lekelenen miktarları hesaplamak için bir 4-PL bir değişken eğim non-lineer regresyon modeli ve kullanımı uyum sağlar test aşı örnekleri mümkün olur. Bu nedenle, rutin analizler için bu modeli kullanın. Test aşı örnekleri TBS / Zwittergent önce membran lekelenen olan 4M üre / TBS veya% 0.01 'ya seyreltilmiş olarak, orijinal test HA ve NA içeriğini belirlemek için her bir örnek için seyreltme faktörü dikkate alınması gereken aşı örnekleri. Her test aşı örnek standart eğri giren bir dizi yoğunluk değerleri için üç farklı dilüsyonları (2 kat fark) çalıştırmak olması tavsiye edilir. Aşı örneklerini test edilen tüm dilüsyonları için standart eğri aralığı daha yüksek yoğunluk değerleri doğru HA ve NA kantifikasyon daha seyreltilmiş olması gerekir. Yoğunluk değerleri düşük sonuna eğrinin altında iseniz, test örnekleri daha düşük bir seyreltme faktörü seyreltilmelidir.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Mevcut tüm influenza A HA dizileri Biyoinformatik analizler HA sadece korunmuş bir bölge olarak HA2 subunit (füzyon peptid) N-terminus doğruladı. Şekil 1'de her bir amino asit pozisyon için belirlenen konsensus dizisi koruma oranını gösterir. İki varyasyonları pozisyonları 2 (L-> I) ve HA2, 14 N-terminal amino asitler 12 (G-N) tespit edildi, ancak bu tür varyasyonlar antikor ve peptit varyantları 6 arasında bağlayıcı etkilemediği bulundu . Uni-1 epitopu (GLFGAIAGFIEGGW), HA karşı evrensel bir antikor geliştirmek için seçilmiştir. Bu antikor viral dizileri için kayda değer bir özgünlük gösterdi ve 13 farklı alt tipi influenza A HA (H1-H13) (Şekil 2) için bağlayıcı yeteneğine sahiptir.
Benzer bir yaklaşım kullanarak, iki evrensel korunmuş dizileri tüm grip A NA Kullanıcı, K-terminus (HCA-3) bir enzimatik olarak aktif sitesi (HCA-2) yakın (Şekil 3A) ve diğer (Şekil 3B) tespit edildi . Bu amino asit dizileri ile Peptitler NA karşı evrensel bir antikor üretmek için antijen olarak kullanılmıştır. Hem epitoplar karşı antikorlar Tüm 9 NA alt tipi bağlayıcı yeteneğine sahip ve böylece viral NA dizileri (Şekil 4), yüksek özgüllük gösteren allantoik veya hücresel proteinlerin çok az çapraz reaktivite gösterdi.
Şekil 5 influenza HA ve NA ölçümü için slot blot yönteminin bir özetini gösterir.
HA ve NA antijen yuvası blot analizi örnekleri Şekil 6 ve 7 'de gösterilmiştir. Şekil 6A ve bir influenza aşısı referans standart ve aşı örnekleri sırasıyla HA antijeni tespiti sonra 6C gösterir temsili sonuçlar. Her bir örnek (standart ya da aşısı) bitişik bir kuyu, iki nüsha halinde çalıştırıldı. Çoğaltır VB göstermelidirr şiddetleri şu tespiti. Antikor dilüsyonları Optimizasyonu, kuluçka ve maruz kalma süresi, kullanılan antikorlar bağlı olarak gerekebilir.
Şekil 6B bir aşı referans standart örnek HA çeşitli konsantrasyonlarda tespiti takiben elde edilen tipik bir standart eğri bir örnek gösterilmiştir. HA antijen konsantrasyonu yuvaya leke chemiluminescence algılama sinyal yoğunluğu ile doğru orantılıdır ve bu konsantrasyon aralığı (,0938-6 mikrogram HA / ml) 4-PL eğri uydurma modeli uyar.
Şekil 7, bir grip aşısı referans standart ve NA aşı örneklerinde antijen tespiti temsilcisi sonuçlar gösterir. Yoğunluk analiz yuvası leke bir aşı referans standart çeşitli dilüsyonları NA antijen tespit edilen sinyalin yoğunluğu NA (Şekil 7A) konsantrasyonu ile orantılı olduğunu göstermiştir. Elde edilen standart eğri Şekil 7B gösterildiği gibi, bu konsantrasyon aralığı (0.039 için 10 mikrogram NA / ml) için 4-PL modeli, uyuyor. 7C gösterir influenza aşısı örnekleri NA içeriği bir yuva blot analizi bir örneği Şekil. Her numune bitişik bir kuyu, iki nüsha halinde ölçüldü.
Şekil 1 influenza A HA füzyon peptid bölgede Uni-1 epitop Koruma oranı.
Mevcut tüm influenza A HA dizileri füzyon peptid (HA2 alt biriminin N-ucu bulunan), HA, sadece evrensel korunmuş bölge olduğunu doğruladı Biyoinformatik analiz eder. Iki pozisyonu 2 varyasyonlar (L-> I) ve 12 (G-> N) 6 bağlayıcı antikor etkileyecek bulunduğunu unutmayın. 13 farklı alt tipi influenza A HA (H1-H13) bağlayıcı yeteneğine sahip evrensel bir antikor Uni-1 epitopu (GLFGAIAGFIEGGW) kullanılarak geliştirilmiştir.
Şekil 2 HA HA karşı evrensel bir antikor tarafından 13 alt tiplerinin belirlenmesi.
13 influenza A virüs alt tiplerinin alantoyik sıvıları HA HA Uni-1 epitop karşı evrensel bir antikor kullanarak proteinlerin tespiti, SDS-PAGE içinde fraksiyone embriyolu yumurta üretilmiştir. NP proteini kontrol yükleme gibi bir tavşan poliklonal NP-spesifik antikor kullanarak tespit edildi. Negatif kontrol (-) bulaşmamış yumurta allantoik sıvı oldu. Pozitif kontrol (+), Birleşik Krallık NIBSC H1 bir referans standart
Şekil 3 influenza A NA enzimatik olarak aktif bir site ve N-ucu yakınında sırası homoloji .
İnfluenza A NA biyoinformatik tarafından enzimatik aktif site (HCA-2) yakınında bulunan bir (Panel A), N-ucu (HCA-3) (Panel B) diğer iki evrensel korunmuş dizileri belirlendi. Peptitler bu korunmuş amino asit dizileri ile sentezlenmiş ve NA karşı evrensel antikorları üretmek için kullanılır.
Şekil 4, NA antikorlar tarafından NA 9 alt tipi Algılama.
Dokuz NA alt tipi influenza A virüsleri alantoyik HCA-2 (Panel A) ve HCA-3 (Panel B) antikorları kullanarak NA proteinleri tespit sıvıları, SDS-PAGE fraksiyone edildi embriyolu yumurta üretilmiştir. NP proteinini kontrol yükleme gibi bir tavşan poliklonal NP-spesifik antikor (Panel C) kullanarak tespit edildi. Negatif kontrol (-) bulaşmamış yumurta allantoik sıvı oldu. Pozitif kontrol (+) A / New Caledonia/20/99 rNA1 çivili allantoik sıvı ve ilgili antiserumlar ile probed.
Şekil 5 influenza aşılarının HA ve NA antijenlerin kantitatif yuvası leke işlem akış şeması.
Slot leke membran yıkama ve engelleme için de örnek seyreltme için gerekli tamponlar ilk hazırlanan ve PVDF membran ve Bio-Dot SF mikrofiltrasyon cihazların montajı için gerekli filtre kağıtları önceden ıslatılmış vardır. Grip aşısı ve referans standart örnekleri HA ya da yuvası blot ile NA algılama için en uygun tamponlar seyreltilir. Bio-Nokta SF mikrofiltrasyon cihazları, üreticinin talimatlarına örnekleri PVDF membran üzerine uygulanır göre monte edilir. HA ve NA antijenleri her antijene karşı evrensel bir antikor kullanarak tespit edilir. HA ve NA kantitatif test örnekleri elde edilen kemilüminesans sinyalleri Dansitometrisi analizi yapılır.
Şekil 6 influenza aşısı örnekleri HA antijen tespiti ve bakınence standart.
Panel A, HA antijen İmmuno takiben elde edilen temsilcisi leke gösterir. HA referans antijen HA / ml ve bir Bio-Dot SF mikrofiltrasyon aparatı ile PVDF membran uygulanan aşılar önce 4M üre / TBS 0.375 mikrogram HA / ml 'lik bir konsantrasyon için seyreltilmiş 0 6 mg konsantrasyonları için seyreltilmiş . HA antijen sonra Uni-1 evrensel bir antikor kullanılarak tespit edildi. Panel B, bir aşı referans standart çeşitli HA konsantrasyonlarının sinyallerini ile elde edilen bir standart eğri bir örnek gösterir. Sinyal yoğunluğu HA konsantrasyonu ile orantılıdır ve eğri 4-PL modeli uyar.
Şekil 7 influenza aşısı örnekleri ve referans standart NA antijen tespiti.
Panel A ve B gösterisi temsilcisi, NA, NA,% 0.01 Zwittergent / TBS ve dansitometrisi analizler sonrasında elde edilen 4-PL standart eğri, 0 ile 10 mikrogram NA / ml arasında değişen konsantrasyonlarda seyreltilmiş bir grip aşısı referans standart olarak tespit edilen sinyaller. Influenza aşısı örnekleri NA antijeni bir slot blot analizi aşağıdaki tespit tipik kemilüminesans sinyalleri bir örnek 1 mg HA / ml 'lik bir konsantrasyon% 0.01 Zwittergent / TBS seyreltilmiş Panel C. Grip aşısı örnekleri gösterilir ve üzerine lekelenen edildi PVDF membran Bio-Dot SF mikrofiltrasyon aparatı kullanarak. NA antijen aşı örneklerinde kantitatif için standart bir eğri oluşturmak amacıyla, 0 ile 2.5 mikrogram NA / ml arasında değişen konsantrasyonları ile ilgili aşı referans standart çözeltiler aynı leke dahil edildi. NA NA ve dansitometrisi analizi yapıldı elde kemilüminesans sinyalleri karşı HCA-2 evrensel bir antikor ile antijen tespit edildi. NA konsantrasyon karşı aşı referans standart için sinyal yoğunluk değerleri komplo tarafından elde edilen 4-PL standart eğri karşı, her aşı örnek NA miktarı hesaplanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Influenza virüs HA ve NA, bu iki yüzey proteinleri bağışıklık yanıtlarını 6-11 indükleyen en önemli viral bileşenler olduğundan kantitatif tayin aşı araştırma ve geliştirme için kritik öneme sahiptir . Daha önce bu proteinlerin tespiti için rapor immünolojik yöntemler, gerginlik spesifik antikorların gerektirir. Antikorlar, sadece evrensel korunmuş epitoplar 6-8 farkındayız beri HA ve NA antijenleri burada açıklanan ölçmek için, basit, tekrarlanabilir ve hızlı yuvası blot yöntemi tüm influenza A virüs HA ve NA proteinleri için uygundur . Bu yöntem ile ilgilenen araştırmacılar için tek zorluk, in-house, evrensel antikorlar olduğunu olabilir. Ancak, bu antikorlar, antijenler olarak peptidler kullanarak nesil rutin bir işlemdir. Varyantları peptidler verilen rekabetçi bir ELISA 6-8 peptid bağlanarak kendi aralarında eşit olarak iyi rekabet nedeniyle ilgilenen bilim adamları açıklanan prosedürlere göre antikorlar kendileri yapabilir, onlar da HA ve NA antikorları yazarları temasa geçebilirsiniz kendi araştırma kullanılır.
Bildiğim kadarıyla yuvası blot assay ile ilgili olarak, yukarıda açıklandığı gibi, sadece bir kaç adım gerekli özel dikkat, oldukça basit. HA ve NA hem de tedavi edilmezse örneklerinde tespit olabilir de, artan hassasiyet örneklerinin bir ön tedavi ile elde edildi.
Basitlik, hız ve tekrarlanabilirlik kendi avantajlarına rağmen, burada açıklanan evrensel bir antikor bazlı yuvası blot yöntemleri belli sınırlamaları vardır. Örneğin, farklı HA ve NA alt tipi ayırt etmek için tasarlanmış değildir ve bu nedenle de kalite kontrol işlem ve / veya monovalan aşı hazırlıkları analizi için muhtemelen daha uygundur. SRID tahlil nedenle influenza aşılarının 3 viral HA alt tipi tanımlamak için tercih edilen bir yöntem olmaya devam etmektedir.
Kısacası, HA ve NA, son derece iyi korunmuş dizileri mono-spesifik antikorların grip viral HA ve NA hemen her suşlarının kantitatif analiz için istihdam edilebilir oluşturmak için seçilmiştir. Iken, bu evrensel HA ve NA karşı antikorlar ile detaylı yuvası leke prosedürü burada sunulan ilgilenen araştırmacılar allantoik ile saptanabilir çapraz reaktivite olmadan viral dizileri karşı olağanüstü özgünlük gösterdi göz önüne alındığında, immunoassay diğer tür temel bir araştırma aracı olarak kullanabilirsiniz veya hücresel proteinlerin. Ayrıca HA evrensel karşı antikorlar, bu antikorların uygulamaları temel araştırma araçları olarak geniş bir yelpazede vurgulamaktadır virüsü ile enfekte hücre kültürlerinde 12, doğal yapısındaki HA tespit olabilir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarların Bayan Monika Tocchi yazının içerik incelemesi için teşekkür etmek istiyorum. AMH, Kanada, Suudi Arabistan Kültür Bürosu aracılığıyla, Kral Abdülaziz Üniversitesi Burs tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus | Bio-Rad | 170-6542 | |
| Bio-Dot SF Filter paper | Bio-Rad | 162-0161 | |
| Immobilon-FL transfer membrane (PVDF) | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| Vacuum pump | EMD Millipore | WP6111560 | |
| Chemiluminescence BioMax Light Film | Kodak | 178 8207 | |
| FluorChem Gel Documentation System | Alpha Innotech | 29-008-1896X | |
| Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens | Uni-1 (HA)HCA-2, HCA-3 (NA) | Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7. | |
| Influenza vaccine reference antigen | CBER/FDA or NIBSC | ||
| Influenza vaccine samples | Commonly available in most countries | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | |
| Zwittergent 3-14 Detergent | Calbiochem | 693017 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 31460 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 34075 |
References
- Webster, R. G., Bean, W. J.
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).
- Wood, J. M. The influence of the host cell on standardisation of influenza vaccine potency. Dev Biol Stand. 98, 183-188 (1999).
- Sylte, M. J., Suarez, D. L. Influenza neuraminidase as a vaccine antigen. Curr Top Microbiol Immunol. 333, 227-241 (2009).
- Bright, R. A., Neuzil, K. M., Pervikov, Y., Palkonyay, L. WHO meeting on the role of neuraminidase in inducing protective immunity against influenza infection. Vaccine. 27, 6366-6369 (2008).
- Chun, S. Universal antibodies and their applications to the quantitative determination of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins. Vaccine. 26, 6068-6076 (2008).
- Gravel, C. Qualitative and quantitative analyses of virtually all subtypes of influenza A and B viral neuraminidases using antibodies targeting the universally conserved sequences. Vaccine. 28, 5774-5784 (2010).
- Li, C. A simple slot blot for the detection of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins using universal antibodies targeting the fusion peptide. Nat Protoc. 5, 14-19 (2010).
- Harvey, R., Wheeler, J. X., Wallis, C. L., Robertson, J. S., Engelhardt, O. G. Quantitation of haemagglutinin in H5N1 influenza viruses reveals low haemagglutinin content of vaccine virus NIBRG-14 (H5N1). Vaccine. 26, 6550-6554 (2008).
- Li, C. Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China. Biologicals. 38, 284-289 (2010).
- Johansson, B. E., Pokorny, B. A., Tiso, V. A. Supplementation of conventional trivalent influenza vaccine with purified viral N1 and N2 neuraminidases induces a balanced immune response without antigenic competition. Vaccine. 20, 1670-1674 (2002).
- Hashem, A. Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus. Biochem Biophys Res Comm. , Forthcoming (2010).
Tags
İmmünoloji Sayı 50 Viroloji grip hemaglutinin nöraminidaz ölçme evrensel bir antikorErratum
Formal Correction: Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays
Posted by JoVE Editors on 11/13/2012.
Citeable Link.
An author's affiliation was omitted from the publication of Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. A third affiliation was added for Anwar M. Hashem:
Microbiology Department, Faculty of Medicine, King Abdulaziz University
