Kvantitativa analyser av alla influensa typ A Viral Hemagglutinins och neuroaminidaser använda Universal antikroppar i enkla mätmetoder Slot Blot

Summary

En enkel slot Blot-teknik har utvecklats för kvantifiering av influensa virus hemagglutinin och neuraminidas med universella antikroppar riktade sina mest bevarade sekvenser identifierats genom bioinformatik analyser. Detta innovativa tillvägagångssätt kan ge ett användbart alternativ till kvantitativ bestämning av alla virala hemagglutinin och neuraminidas.

Abstract

Hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) är två ytproteiner av influensavirus som är kända för att spela viktiga roller i virusets livscykel och induktion av skyddande immunsvar ^1,2. Som det främsta målet för neutraliserande antikroppar är HA idag används som influensavaccin styrkan markör och mäts genom en enda radiell immunodiffusion (SRID) ^3. Däremot orsakar beroende av SRID på tillgången på motsvarande subtyp-specifika antiserum minst 2-3 månader försening för frisläppandet av varje nytt vaccin. Dessutom, trots bevis på att NA också inducerar skyddande immunitet ^4, mängden NA i influensavacciner är ännu inte standardiserad på grund av brist på lämpliga reagenser eller analytisk metod ^5. Således enkla alternativa metoder som kan kvantifiera HA-och NA-antigen är önskvärda för snabb release och bättre kvalitetskontroll av influensavaccin.

Universellt konserverade regioner i alla tillgängliga influensa A HA-och NA sekvenser identifierades av bioinformatik analyser ^6-7. En sekvens (som betecknas som Uni-1) har identifierats i den enda universellt bevaras epitop av HA, fusion peptiden ^6, medan två bevarade sekvenser identifierades neuroaminidaser, en nära den enzymatiska aktiva området (som betecknas som HCA-2) och andra nära den N-terminalen (som betecknas som HCA-3) ^7. Peptider med dessa aminosyrasekvenser var syntetiseras och användas för att immunisera kaniner för produktion av antikroppar. Antikroppen mot Uni-1 epitopen av HA kunde binda till 13 subtyper av influensa A HA (H1-H13) medan antikroppar mot HCA-2 och HCA-3 regioner i NA var kan binda alla 9 NA-subtyper. Alla antikroppar visade anmärkningsvärd specificitet mot virala sekvenser vilket framgår av iakttagelse att ingen korsreaktivitet mot allantois proteiner upptäcktes. Dessa universella antikroppar används sedan för att utveckla analyser slot blot att kvantifiera HA-och NA i influensa A vaccin utan behov av särskilda antisera ^7,8. Vaccin prover appliceras på en PVDF membran med hjälp av en apparat slot blot tillsammans med standardlösningar utspädd till olika koncentrationer. För detektering av HA, togs prover och standard first späds ut i Tris-buffrad saltlösning (TBS) med 4M urea samtidigt för mätning av NA: de var utspädd i TBS som innehåller 0,01% Zwittergent eftersom dessa tillstånd avsevärt förbättrat känslighet. Efter upptäckten av HA-och NA-antigen genom immunoblotting med sina respektive universella antikroppar, var signalen intensiteter kvantifieras av densitometri. Mängder av HA-och NA i vacciner sedan beräknas med hjälp av en standardkurva etablerats med den signal intensiteten hos olika koncentrationer av använda referenser.

Med tanke på att dessa antikroppar binder till universella epitoper i HA eller NA, kan intresserade utredare använda dem som forskningsverktyg i immunoanalyser än facket blot bara.

Protocol

1. Beredning av reagens och utrustning

1. Innan du börjar proceduren facket blot, förbereda 20_mls av 4M urealösning i Tris buffrad-saltlösning (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7,6) (TBS) för hemagglutinin, eller HA, slot blot eller 20_mls en 0,01% Zwittergent lösning i TBS för neuraminidas, eller NA, slot blot. Medan 4M urea bör beredas på nytt varje gång, är en 10% Zwittergent stamlösning i dH ₂ O stabilt i minst 6 månader i rumstemperatur och kan därför spädas till 0,01% i TBS före varje analys.
2. Förbered 2000 ml av tvättlösningen genom att lägga till Tween-20 till en TBS lösning till en slutlig koncentration av 0,1%. Förbered 80 MLS blockerande buffert genom att lösa skummjölkspulver (blotting klass fettfri torr mjölk) till en slutlig koncentration på 5% w / v i tvätt buffert.
3. Aktivera PVDF membran (pre-cut till en 9 x 12 cm storlek) i metanol i 15 sekunder, följt av en 2 minuter skölj i DDH ₂ O. Blötlägg membranet i TBS till användning. Pre-våta 3 ark Bio-Dot SF filterpapper i TBS tills det används.

2. Beredning av prover influensavaccin och referens standard för HA-kortplats blot

Influensavaccin referensstandarder med förutbestämd HA innehåll motsvarar vaccinstammar som ska testas erhölls från Centrum för Biologics utvärdering och forskning (CBER / FDA, USA) eller det nationella institutet för biologisk standard och kontroll (NIBSC, Storbritannien) och används för HA-kvantifiering av facket blot. Utredarna kunde också laga sin egen antigen standarder genom etablerade förfaranden som beskrivs i referenserna 9 och 10.

1. För HA referens antigener och proverna vaccin: Späd HA beståndet referens-antigen i 4M urea / TBS till följande nivåer: 0, 0,0938, 0,1875, 0,375, 0,75, 1,5, 3 och 6 mikrogram HA / ml. Blanda väl. Sedan Späd prover vaccin för humant bruk från vaccin producenter eller gjorda in-house för forskningsändamål i 4M urea / TBS och blanda väl. Även kopior av referens antigen och prover vaccin kan köras, är tre exemplar föredra. Förbered tre spädningar av varje prov (2-faldig skillnad) för att provet koncentration att omfattas av standardkurvan. Förbered 450 l eller 650 l av varje referens antigen eller testa vaccin provspädning att köra dubbletter eller tre exemplar respektive. Monovalenta influensa A-vacciner kan testas med denna plats blot metod. HA innehåll referens antigener tidigare bestäms med hjälp SRID som är den för närvarande används standardtest för förberedelserna influensavaccin. HA innehåll bestäms av SRID användes som första referens antigen lager HA koncentrationen för beredning av spädningar för hållaren blot standardkurvan.

3. Beredning av prover influensavaccin och referens standard för NA-kortplats blot

Influensavaccin referensstandarder motsvarar vaccinstammar som ska testas erhölls från Centrum för Biologics utvärdering och forskning (CBER / FDA, USA) eller det nationella institutet för biologisk standard och kontroll (NIBSC, Storbritannien) och används för NA kvantifiering med kortplats blot. NA innehållet i dessa referensprover bestämdes genom SDS-PAGE analys av deglycosylated prover i samband med densitometri skanning analys, som beskrivits tidigare ^9, med smärre ändringar ^10. I korthet var deglycosylated vaccinet referensprover (5 mikrog) blandas med provet buffert och lastas på gelen. Gelen kördes vid 20 mA ca 90 min tills spårning dye precis slut på gelen, följt av Sypro färgning. Densitometri kvantifiering av proteiner genomfördes med hjälp av en Fluorchem gel dokumentationssystem (Alpha Innotech). Mängden NA var bestäms utifrån förhållandet mellan NA proteiner till den totala proteiner som bestäms av Lowry analysen. Referens prov som har beretts med denna metod kan sedan användas i kortplats blot för kvantifiering av NA innehållet i vaccinet prover från vacciner tillverkare.

1. För NA referens antigener och proverna vaccin: Späd NA beståndet referens-antigen i 0,01% Zwittergent / TBS till följande nivåer: 0, 0,039, 0,078, 0,1562, 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5 och 10 mikrogram NA / ml. Blanda väl. Sedan Späd prover vaccin för humant bruk från vaccin producenter eller gjorda in-house för forskningsändamål på 0,01% Zwittergent / TBS och blanda väl. Även kopior av referens antigen och prover vaccin kan köras, är tre exemplar föredra. Förbered tre spädningar av varje prov (2-faldig skillnad) för att provet koncentration att omfattas av standardkurvan. Förbered 450 l eller 650 l av varje referens antigen eller testa vaccin provspädning att köra dubbletter eller tre exemplar respektive. Monovalenta influensa A-vacciner kan testas with denna plats blot metod.

4. Montering av Bio-Dot SF Mikrofiltrering apparater och blotting av prover på PVDF membran

1. Montera en tidigare rengjorts och torkats Bio-Dot SF Mikrofiltrering apparater. Placera plattan packningen stöd i vakuum grenröret och placera packningen på top.Place de 3 fuktad ark Bio-Dot SF filterpapper över packningen, följt av den i blöt PVDF membran. Placera provet mallen ovanpå membranet och finger-dra åt de fyra skruvarna med en diagonal korsning mönster för att säkerställa en enhetlig tillämpning av tryck på membranets yta.
2. Kontrollera att 3-vägs ventilen är inställd på att utsätta vakuum grenrör till vakuumkällan bara innan du slår på pumpen och ansluta vakuum.
3. Slå på pumpen och anslut till Bio-Dot apparater. Se till att flödet ventilen är placerad på en nivå under provet brunnar för snabb och fungerande dränering av proverna i följande steg.
4. Upprepa skruven skärpning steg med diagonala korsningen mönster. Dra åt skruvarna när vakuum appliceras ger en tätare tätning och förhindrar korskontaminering mellan brunnar.
5. Ändra flödesventil att exponera vakuum grenrör till luft och stänga av pumpen.
6. Tillsätt 100 ìl av TBS till alla brunnar med hjälp av en flerkanalspipett att rehydrera membranet vilket garanterar enhetliga bindande av antigenet. Försiktighet måste iakttas för att undvika bildandet av bubblor och att tillämpa lösningen i mitten av väl, så nära botten som möjligt, för att täcka öppningen jämnt. Burst någon luftbubbla misstag inleds med en pipett spets.
7. Ändra flödesventil att exponera grenröret till både luft och vakuum, slå på pumpen, och försiktigt tömma bufferten från brunnarna genom att sätta ett finger över hamnen utsätts för luft för att reglera mängden vakuum.
8. Ändra flödesventil att exponera grenrör till luft så fort bufferten helt runnit ur alla brunnar. Stäng av pump eller koppla ur vakuum.
9. Applicera 200 l av varje standard eller vaccin provspädning per brunn. Pipettera prov ett i taget, i mitten av varje brunn, så nära botten som möjligt, ta hand för att undvika att införa luftbubblor. Burst någon luftbubbla misstag inleds med en pipett spets. Sätt 200 ìl av provspädning buffert (4M urea / TBS eller 0,01% Zwittergent / TBS) i oanvända brunnar för att säkerställa korrekt vakuum till brunnarna i bruk.
10. Justera flödesventil att exponera grenröret till både luft och vakuum. Sätt på pumpen (eller anslut vakuum) och försiktigt låta proverna att helt dränera från brunnarna genom att kontrollera mängden vakuum med ett finger över hamnen utsätts för luft. Ta bort fingret från hamnen för att lossa vakuum så snart som alla prover har tömts.
11. Tillsätt omedelbart 200 ìl av TBS till varje brunn med en flerkanalspipett. Applicera en mjuk vakuum för att tömma och tvätta brunnarna genom att kontrollera mängden vakuum med ett finger över hamnen utsätts för luft.
12. Upprepa tvättningen beskrivs i steg 4,11. Så snart brunnarna helt har tömts, lossa skruvarna i provet mallen och stänga av vakuum för att undvika overdrying brunnarna. Fortsätt omedelbart att ta bort membranet.
13. Placera membranet i blockerande buffert och inkubera över natten vid 4 ° C, med varsam gungning. Använd tillräckligt blockerande buffert helt täcka membranet.

5. Immunoblotting av HA-och NA-antigen

1. Efter den natten inkubation i blockerande buffert, tvätta membran två gånger i 5 minuter med TBS/0.1% Tween-20 tvätt buffert. För alla tvättar och inkubation, se till att membranet är helt täckt med lösningen.
2. Inkubera membranet med en universell kanin antikropp mot HA (t.ex. Uni-1) eller NA (såsom HCA-2 eller HCA-3) utspädd i 5% w / v BSA i tvätt-buffert i en timme vid rumstemperatur, med milda gunga. Optimal antikroppskoncentration måste fastställas för varje antikropp lager. Spädningar av 1:4000 av kanin anti-serum gav optimalt resultat för ovan nämnda antikroppar.
3. Tvätta membran tre gånger, vid rumstemperatur med mjuka gungande i 15 minuter varje gång, för att avlägsna obundet primära antikroppar.
4. Inkubera membran med en HRP-konjugerat anti-kanin sekundär antikropp. Använd en 1:50000 spädning av Thermo ImmunoPure get anti-kanin IgG, peroxidas antikropp i blockerande buffert och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter med varsam gungning.
5. Tvätta membran tre gånger, gunga i 15 minuter varje gång, vid rumstemperatur med tvätt buffert för att avlägsna obundet sekundära antikroppar.
6. Tvätta membran med TBS i 5 minuter med varsam gungande för att avlägsna rester Tween-20 diskmedel från membranet ytan.
7. Förbered underlaget med 3 ml av varje reagent från Supersignal väst Dura långvariga Substrat kit från Thermo Scientific och blanda väl.
8. Placera membranet på ett torrt papper för att försiktigt ta bort överflödigt TBS buffert.
9. Överför membranet till en torr behållare och lägga underlaget till att omfatta hela membranet. Inkubera 5 minuter med mjuka gungande, vid rumstemperatur.
10. Ta bort överflödigt substratet genom att försiktigt blotting membranet på mjukpapper.
11. Exponera membranet till en kemiluminiscens film. Längden på exponeringen måste optimeras för att undvika att signalen mättnad, men normalt varierar mellan 10 sekunder till 10 minuter.
12. Utför densitometri analyser på den framkallade filmen med hjälp av en apparat gel avbildning som Fluorchem gel dokumentationssystem (Alpha Innotech) enligt tillverkarens anvisningar. Densiteten värden för varje uppsättning av replikat av referens antigener och proverna vaccin sedan beräknas. Medan antigen standarder och prover vaccin kan köras i dubletter, är tre exemplar föredra. Densitet värden för replikat bör vara väldigt lika. Signifikanta skillnader mellan replikat indikerar en trolig tekniskt problem under förfarandet. En koncentrationsberoende standardkurva har fastställts genom att plotta genomsnittliga densiteten jämfört med det belopp (i ng) av HA eller NA-antigen sätta i varje fack, från referensstandard. Hjälp av lämpliga montering kalibreringskurva i immunoanalyser är avgörande för att kvantifiera HA-och NA korrekt. Linjär regression, som erhållits genom plottning svaret (y) kontra koncentration (x) med hjälp av den linjära delen av responskurvan (y = mx + b) är den enklaste metod för kvantifiering av analyter. Om ett bredare utbud av analyter anses för koncentration beräkningen bör fyra parametern logistik (4PL) modell för immunologiska testsystem för närvarande tillåts användas. En mängd programvara är tillgänglig för intresserade utredare att överväga. När det gäller de beskrivna slot blot analys, konvertera x-axeln värden för att logga skala gör att kurvan för att passa en 4-PL-modellen och användning av en variabel lutning icke-linjär regression för att beräkna utplånade mängder av HA och NA i de testade vaccinet proverna är alltså möjligt. Vi därför rutinmässigt använda denna modell för våra analyser. Eftersom testet vaccinet proverna spädas ut i antingen 4M urea / TBS eller 0,01% Zwittergent / TBS innan de torkas på membranet, måste spädningsfaktorn för varje prov som ska beaktas för att fastställa HA-och NA innehållet i det ursprungliga provningen Vaccinet prover. Det föreslås att varje test vaccin prov köras på tre olika spädningar (2-faldig skillnad) för att en uppsättning densitetsvärden falla inom standardkurvan. Densitet högre värden än standardkurvan sortiment för alla testade spädningar av vaccinet prov kan sedan spädas ytterligare för noggrann HA eller NA kvantifiering. Om densiteten värdena ligger under den nedre delen av kurvan, bör proverna spädas på en lägre utspädningsfaktorn.

6. Representativa resultat:

Bioinformatik analys av alla tillgängliga influensa A HA-sekvenser bekräftade N-terminalen av HA2 subenhet (fusion peptid) som den enda bevarade delen av HA. Figur 1 visar bevarande skattesats för varje aminosyra position identifierade konsensus sekvensen. Två varianter identifierades i position 2 (L-> I) och 12 (G-> N) av de 14 N-terminala aminosyror HA2, men sådana variationer visade sig inte påverka bindande mellan antikroppar och peptiden varianter ⁶ . Uni-1 epitopen (GLFGAIAGFIEGGW) valdes för att utveckla en universell antikropp mot HA. Denna antikropp visade anmärkningsvärda specificitet för viral sekvenser och kan binda till 13 olika subtyper av influensa A HA (H1-H13) (Figur 2).

Med hjälp av en liknande metod har två allmänt bevarade sekvenser identifierats i alla influensa A NA: s, en nära den enzymatiskt aktiva platsen (HCA-2) (Figur 3A) och den andra vid N-terminalen (HCA-3) (Figur 3B) . Peptider med dessa aminosyrasekvenser användes som antigen för att skapa universella antikroppar mot NA. Antikropparna mot både epitoper kunde binda till alla 9 subtyper av NA och visade väldigt lite korsreaktivitet mot allantois eller cellulära proteiner, vilket visar hög specificitet för viral NA sekvenser (Figur 4).

Figur 5 visar en översikt av facket blot metod för kvantifiering av influensa HA-och NA.

Exempel på HA-och NA-antigen slot blot-analys visas i figurerna 6 och 7. Figur 6A och 6C visar representativa resultat efter upptäckt av HA-antigen i ett influensavaccin referensstandard och prover vaccin respektive. Varje prov (standard eller vaccin) kördes i två exemplar på intilliggande brunnar. Dubbletter ska visa Similär intensitet efter upptäckt. Optimering av antikropp spädningar, inkubation och exponeringstid kan krävas beroende på vilken antikroppar.

Ett exempel på en typisk standardkurva erhålls efter upptäckt av olika koncentrationer av HA från ett vaccin referensstandard prov visas i figur 6B. Koncentrationen av HA-antigen är proportionell till signalen intensiteten följande kemiluminiscens upptäckt av facket blot och passar den 4-PL kurvanpassning modell för detta koncentrationsintervall (0,0938 till 6 mikrogram HA / ml).

Figur 7 visar representativa resultat för upptäckt av NA-antigen i ett influensavaccin referensstandard och i vaccinet prover. Densitet analys visade att intensiteten i den signal som erhålls genom att upptäcka NA-antigen i olika spädningar av ett vaccin referensstandard med kortplats blot är proportionell mot koncentrationen av NA (Fig. 7A). Den resulterande Standardkurvan passar en 4-PL modell för detta koncentrationsintervall (0,039 till 10 mikrogram NA / ml), som visas i figur 7B. Figur 7c visar ett exempel på en enarmad blot analys av NA-halten i prov influensavaccin. Varje prov analyserades i duplikat, i närliggande brunnar.

Figur 1. Bevarande hastighet av Uni-1 epitop på fusion peptiden regionen av influensa A-HA.
Bioinformatik analys av alla tillgängliga influensa A HA sekvenser bekräftat att fusion peptid (ligger vid N-terminalen av HA2 subenheten) är den enda universellt bevaras regionen HA. Observera att de två varianter på position 2 (L-> I) och 12 (G-> N) visade sig inte påverka antikroppsbindningen ^6. En universell antikroppar som kan binda 13 olika subtyper av influensa A HA (H1-H13) utvecklades med hjälp av Uni-1 epitopen (GLFGAIAGFIEGGW).

Figur 2. Detektion av 13 subtyper av HA med allmän antikropp mot HA.
Allantoisvätska av 13 subtyper av influensa A-virus odlat i embryonerade ägg fraktionerade i SDS-PAGE, följt av detektion av HA proteiner använder det generella antikroppar mot Uni-1 epitope av HA. NP protein påvisades som lastning kontroll med hjälp av en kanin polyklonal NP-specifik antikropp. Negativ kontroll (-) var allantoisvätska från oinfekterade ägg. Positiv kontroll (+) var en referens standard H1 från NIBSC, Storbritannien

Figur 3. Sekvenshomologi av influensa A NA: s nära den enzymatiskt aktiva webbplatsen och N-terminalen.
Två universellt bevaras sekvenser identifierades i influensa A NA: s av bioinformatik, ett beläget nära den enzymatiska aktiva platsen (HCA-2) (Panel A), den andra vid N-terminalen (HCA-3) (panel B). Peptider med dessa bevaras aminosyrasekvenser var syntetiseras och användas för att generera universella antikroppar mot NA.

Figur 4. Upptäckt av 9 subtyper av NA NA antikroppar.
Allantoisvätska av nio NA subtyper av influensa A-virus odlat i embryonerade ägg fraktionerade i SDS-PAGE, följt av detektion av NA proteiner med HCA-2 (panel A) och HCA-3 (Panel B) antikroppar. NP protein påvisades som lastning kontroll med hjälp av en kanin polyklonal NP-specifik antikropp (Panel C). Negativ kontroll (-) var allantoisvätska från oinfekterade ägg. Positiv kontroll (+) var allantoisvätska tillsattes rNA1 av A / New Caledonia/20/99 och sonderade med motsvarande antiserum.

Figur 5. Flödesschema för facket blot förfarandet för kvantifiering av HA-och NA-antigen i influensavacciner.
De buffertar som behövs för provspädning liksom för tvätt och blockera membran facket blot bereds först och PVDF membran och filter papper som behövs för montering av Bio-Dot SF mikrofiltrering apparater i blöt. Influensavaccin och referens prover standard späds ut i den optimala buffertar för HA eller NA upptäckt av facket blot. Bio-Dot SF mikrofiltrering apparaten är monterad enligt tillverkarens anvisningar och prover appliceras på PVDF membran. HA-och NA-antigen detekteras med hjälp av den universella antikroppar mot respektive antigen. Densitometri analys utförs på kemiluminiscens signaler erhållas för kvantifiering av HA-och NA i prover.

Figur 6. Identifiering av HA-antigen i prov influensavaccin och hänvisaENCE standard.
Panel A visar ett representativt blot erhölls efter immunodetection av HA-antigen. HA referens antigen som spätts till koncentrationer från 0 till 6 mikrogram HA / ml och vacciner spädas till en koncentration av 0,375 mikrogram HA / ml i 4M urea / TBS innan de tillämpas på ett PVDF membran med en Bio-Dot SF mikrofiltrering apparater . HA-antigen sedan detekteras med Uni-1 universell antikropp. Panel B visar ett exempel på en standardkurva erhålls genom att upptäcka signaler av olika HA koncentrationer från ett vaccin referensstandard. Signalen intensitet är proportionell mot koncentrationen av HA och kurvan passar en 4-PL-modellen.

Figur 7. Detektering av NA-antigen i prov influensavaccin och referens standard.
Panel A och B visar representativa signaler som erhålls vid upptäckt av NA i ett influensavaccin referensstandard utspädd till NA koncentrationer från 0 till 10 mikrogram NA / ml i 0,01% Zwittergent / TBS och den resulterande 4-PL standardkurva följande densitometri analyser. Ett exempel på typiska kemiluminiscens signaler upptäcktes efter en plats blot analys av NA-antigen i prov influensavaccin visas i panelen C. Influensavaccin prover spädas till en koncentration av 1 mikrogram HA / ml i 0,01% Zwittergent / TBS och var utplånas på en PVDF membran med hjälp av en Bio-Dot SF mikrofiltrering apparater. Spädningar av den motsvarande vaccin referens standard, med koncentrationer mellan 0 till 2,5 mikrogram NA / ml, var med på samma fläck i syfte att skapa en standard kurva för kvantifiering av NA-antigen i vaccinet prover. NA-antigen upptäcktes med HCA-2 universal antikropp mot NA och densitometri analys av kemiluminiscens signaler som erhållits utfördes. Mängden NA i varje vaccin prov kan beräknas mot 4-PL standardkurva erhålls genom att plotta värdena signalstyrkan kontra NA koncentrationen för vaccinet referensstandard.

Discussion

Kvantitativ bestämning av influensa virus HA-och NA är kritiska för vaccin forskning och utveckling eftersom dessa två ytproteiner som är viktigast virala komponenter inducera immunsvar ^6-11. Tidigare redovisade immunologiska metoder för detektion av dessa proteiner kräver stam specifika antikroppar. Den enkla, reproducerbar och snabb slot blot metod för att kvantifiera HA-och NA-antigen som beskrivs här är lämpliga för alla influensa A virus HA-och NA proteiner eftersom antikropparna känner igen deras enda universellt bevaras epitoper ^6-8. Den enda svårigheten för utredare intresserad av denna metod kan vara att de inte har någon sådan universell antikroppar i egen regi. Det är dock generationen av dessa antikroppar med hjälp av peptider som antigen en rutin. Medan intresserade forskare kan göra antikroppar sig enligt de beskrivna förfarandena eftersom varianterna peptider konkurrera lika bra sinsemellan för bindning till den givna peptid i ett kompetitivt Elisa ^6-8, kan de också kontakta författarna för HA-och NA-antikroppar som används i deras förberedande forskning.

När det gäller facket blot-analysen är, är det ganska enkelt, med särskild uppmärksamhet behövs på bara några steg, som beskrivs ovan. Även HA-och NA kunde båda detekteras i obehandlade proverna var ökad känslighet uppnås genom en förbehandling av prover.

Trots deras fördelar av enkelhet, snabbhet och reproducerbarhet, den universella antikroppsbaserade slot blotting metoder som beskrivs här har vissa begränsningar. Till exempel, de är inte utformade för att särskilja olika HA eller NA-subtyper och som sådan är kanske mer lämpade för processkontroll kvalitetskontroll och / eller analyser av monovalent vaccin förberedelser. Den SRID analysen förblir därför en lämplig metod för att identifiera subtyper av virus HA i influensavacciner ^3.

I korthet har de starkt konservativa sekvenser i HA-och NA valts ut för att generera mono-specifika antikroppar, som kan användas för kvantitativa analyser av praktiskt taget alla stammar av influensa virus HA-och NA. Medan den detaljerade facket blot förfarande med dessa universella antikroppar mot HA-och NA presenteras här, kan intresserade utredare använda dem som en grundforskning verktyg i andra typer av immunologisk, eftersom de visat anmärkningsvärd specificitet mot virala sekvenser utan att upptäckas korsreaktivitet med allantois eller cellulära proteiner. Värt att notera är att den allmänna antikroppar mot HA kan upptäcka HA i inhemska konformation i virusinfekterade cellkulturer ^12, som belyser ett bredare spektrum av tillämpningar av dessa antikroppar som grundforskning verktyg.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus	Bio-Rad	170-6542
Bio-Dot SF Filter paper	Bio-Rad	162-0161
Immobilon-FL transfer membrane (PVDF)	EMD Millipore	IPFL00010
Vacuum pump	EMD Millipore	WP6111560
Chemiluminescence BioMax Light Film	Kodak	178 8207
FluorChem Gel Documentation System	Alpha Innotech	29-008-1896X
Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens		Uni-1 (HA)HCA-2, HCA-3 (NA)	Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7.
Influenza vaccine reference antigen	CBER/FDA or NIBSC
Influenza vaccine samples			Commonly available in most countries
Urea	Sigma-Aldrich	U1250
Zwittergent 3-14 Detergent	Calbiochem	693017
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk	Bio-Rad	170-6404
ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated	Thermo Fisher Scientific, Inc.	31460
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	34075