Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

نوع التحاليل الكمية للجميع الأنفلونزا من Hemagglutinins الفيروسية وNeuraminidases باستخدام الاجسام المضادة العالمي في فتحة بسيطة فحوصات لطخة

Published: April 4, 2011 doi: 10.3791/2784
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1,3,4, 1, 5, 5, 1,3
1Centre for Vaccine Evaluation, Biologics and Genetic Therapies Directorate, HPFB, Health canada, 2National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, The State Food and Drug Administration, Beijing, 3Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 4Microbiology Department, Faculty of Medicine, King Abdulaziz University, 5National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canada
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

وقد وضعت وصمة فتحة بسيطة طريقة لتقدير حجم راصة دموية الأنفلونزا الفيروسية والنيورامينيديز باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف الجميع متواليات الأكثر حفظا تم تحديدها من خلال تحليل المعلومات البيولوجية. قد يكون هذا النهج المبتكرة توفر بديلا مفيدا لتحديد الكمي للجميع راصة دموية الفيروسية والنورامينيداز.

Abstract

راصة دموية (HA) والنورامينيداز (NA) واثنين من البروتينات السطحية فيروسات الانفلونزا التي هي معروفة للعب أدوار مهمة في دورة الحياة الفيروسية وتحريض واقية 1،2 الاستجابات المناعية. والهدف الرئيسي لتحييد الأجسام المضادة ، ويستخدم حاليا HA باعتبارها قوة علامة لقاحات الأنفلونزا ويقاس بواسطة المناعي الشعاعي واحد (SRID) 3. ومع ذلك ، فإن اعتماد SRID على توافر الأمصال الضدية المقابلة سلالة معينة يؤدي إلى الحد الأدنى من 2-3 أشهر من التأخير من اجل الافراج عن كل لقاح جديد. علاوة على ذلك ، على الرغم من الأدلة التي NA يدفع أيضا مناعة وقائية 4 ، ومبلغ NA في لقاحات الأنفلونزا ليست موحدة حتى الآن بسبب عدم وجود الكواشف التحليلية المناسبة أو الأسلوب 5. وهكذا ، وطرق بديلة قادرة على تحديد كمية بسيطة HA و NA المستضدات المرغوب فيه الإفراج السريع ، وتحسين مراقبة جودة لقاحات الأنفلونزا.

وقد تم تحديد مناطق الحفظ عالميا في جميع الأنفلونزا A HA المتاحة ومتواليات بواسطة NA التحليلات المعلوماتية الحيوية 6-7. وقد تم تحديد سلسلة واحدة (تسمى يوني - 1) في حاتمة فقط الحفظ عالميا HA ، والانصهار الببتيد 6 ، في حين تم التعرف على اثنين من متواليات المحفوظة في neuraminidases ، واحدة بالقرب من موقع نشط الأنزيمية (تسمى HCA - 2) و أخرى على مقربة من محطة - N (تسمى HCA - 3) 7. وتوليفها مع هذه الببتيدات تسلسل الأحماض الأمينية وتستخدم لتحصين الأرانب لإنتاج الأجسام المضادة. والجسم المضاد ضد حاتمة يوني - 1 هكتار قادرة على ربط إلى 13 ألف هكتار من الأنواع الفرعية (H1 - H13) في حين أن الأجسام المضادة أنفلونزا ضد HCA - 2 - 3 وHCA مناطق NA كانت قادرة على ربط جميع NA 9 أنماط فرعية. وأظهرت جميع الأجسام المضادة ضد خصوصية ملحوظة في تسلسل الفيروسي كما يتضح من ملاحظة أن تم الكشف عن أي عبر تفاعل البروتينات إلى السقاء. ثم استخدمت هذه الأجسام المضادة عالمية لتطوير المقايسات صمة فتحة لقياس HA و NA في لقاحات الأنفلونزا دون الحاجة للأمصال مضادة محددة 7،8. وطبقت على عينات لقاح غشاء PVDF باستخدام جهاز لطخة فتحة مع المعايير المرجعية المخفف لتركيزات مختلفة. للكشف عن HA ، تم تخفيفه واول عينات قياسية في تريس - مخزنة المالحة (TBS) التي تحتوي على اليوريا في حين 4M لقياس NA أنها كانت مخففة في TBS تحتوي على 0.01 ٪ كما Zwittergent هذه الظروف تحسنت بشكل ملحوظ لحساسية الكشف. في أعقاب الكشف عن المستضدات وHA NA بواسطة immunoblotting مع الأجسام المضادة على الصعيد العالمي منها ، وكانت إشارة من كميا شدة كثافة. ثم حسبت كميات من HA و NA في اللقاحات باستخدام منحنى القياسية التي أقيمت مع شدة إشارة لتركيزات مختلفة من المراجع المستخدمة.

بالنظر إلى أن هذه الأجسام المضادة ربط الحواتم العالمية في HA أو NA ، يمكن للمحققين المهتمة استخدامها كأدوات بحث في المناعية الأخرى من لطخة فتحة فقط.

Protocol

1. إعداد الكواشف والمعدات

  1. قبل البدء في إجراء فتحة لطخة ، وإعداد 20_mls من محلول اليوريا في تريس - 4M مخزنة المالحة Zwittergent (TBS) لراصة دموية ، أو HA ، لطخة فتحة ، أو 20_mls من 0.01 ٪ (20 ملي تريس و 137 ملي مول كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.6) الحل في لTBS النورامينيداز ، أو NA ، لطخة الفتحة. في حين ينبغي أن نكون مستعدين اليوريا 4M جديدة في كل مرة ، وهو 10 ٪ في محلول المخزون Zwittergent درهم 2 O ثابت لمدة 6 أشهر على الأقل في درجة حرارة الغرفة وبالتالي يمكن تخفيفه إلى 0.01 ٪ في TBS قبل كل فحص.
  2. إعداد 2000 مليليتر من غسل العازلة بإضافة توين - 20 إلى حل TBS إلى تركيز النهائي من 0.1 ٪. إعداد 80 مليليتر من عازلة تمنع عن طريق إذابة مسحوق الحليب الخالي من الدسم (النشاف الصف غير دهن الحليب الجاف) إلى التركيز النهائي 5 ٪ ث / ت في غسل العازلة.
  3. تنشيط الغشاء PVDF (قبل خفض لحجم 12 سم × 9) في الميثانول لمدة 15 ثانية ، تلتها دقيقة 2 شطف في DDH 2 O. نقع في الغشاء TBS حتى الاستخدام. قبل 3 الرطب ورقة من ورق بيو دوت مرشح سادس في TBS حتى استخدامها.

2. إعداد عينات لقاح الأنفلونزا ومعيار مرجعي لطخة فتحة HA

تم الحصول على معايير مرجعية لقاح الانفلونزا مع محتوى HA سلفا المقابلة لسلالات لقاح لفحصها من مركز التقييم البيولوجي والأبحاث (CBER / FDA ، الولايات المتحدة الأمريكية) أو المعهد الوطني للمعيار البيولوجي والتحكم (NIBSC ، المملكة المتحدة) و وتستخدم لتقدير HA بواسطة طخة الفتحة. يمكن للمحققين أيضا إعداد معاييرها الخاصة باستخدام مستضد الإجراءات المعمول بها على النحو المبين في مراجع 9 و 10.

  1. لمستضدات HA المرجعية وعينات اختبار لقاح : خفف من مستضد المرجعية HA الأسهم في اليوريا 4M / TBS للتركيزات التالية : 0 ، 0.0938 ، 0.1875 ، 0.375 ، 0.75 ، 1.5 ، 3 و 6 HA ميكروغرام / مل. مزيج جيد. ثم تمييع عينات اختبار لقاح للاستعمال البشري التي تم الحصول عليها من المنتجين لقاح أو مصنوعة في المنزل لأغراض البحث العلمي في اليوريا 4M / TBS وتخلط جيدا. بينما يمكن تشغيل التكرارات من مستضد المرجعية وعينات لقاح ، ويفضل triplicates. 3 تحضير التخفيفات من كل عينة (2 أضعاف الفرق) للسماح للتركيز العينة تقع ضمن منحنى القياسية. إعداد 450 أو 650 ميكرولتر ميكرولتر من كل مستضد أو إشارة اختبار تخفيف عينة لقاح لتشغيل مكررة أو triplicates على التوالي. ويمكن اختبار لقاحات الانفلونزا والتكافؤ مع هذا الأسلوب لطخة فتحة. وكان سبق تحديدها محتوى هكتار من المستضدات المرجعية باستخدام SRID الذي هو اختبار القياسية المستخدمة حاليا للتحضير لقاح الانفلونزا. تم استخدام المحتوى HA يحددها SRID كما مستضد المرجعية الأولي لأسهم تركيز HA إعداد التخفيفات لطخة فتحة منحنى القياسية.

3. إعداد عينات لقاح الأنفلونزا ومعيار مرجعي لطخة فتحة NA

تم الحصول على معايير مرجعية لقاح الانفلونزا المقابلة لسلالات لقاح لفحصها من مركز التقييم البيولوجي والأبحاث (CBER / FDA ، الولايات المتحدة الأمريكية) أو المعهد الوطني للمعيار البيولوجي والتحكم (NIBSC ، المملكة المتحدة) وتستخدم لتقدير NA لطخة بواسطة الفتحة. تم تحديد محتوى هذه العينات من NA إشارة SDS - PAGE تحليل عينات deglycosylated بالتزامن مع تحليل كثافة المسح ، كما هو موضح سابقا 9 ، 10 مع تعديلات طفيفة. باختصار ، كانت مختلطة الاشارة قاح deglycosylated عينات (5 ميكروغرام) مع عينة العازلة وتحميلها على هلام. تم تشغيل هلام في 20 مللي أمبير لحوالي 90 دقيقة حتى الصبغة تتبع تشغيل للتو من هلام ، تليها تلطيخ Sypro. أجري تقدير الكثافة من البروتينات خارج باستخدام وثائق جل Fluorchem النظام (Innotech ألفا). وقد تم تحديد مبلغ NA على أساس نسبة من البروتينات NA إلى مجموع البروتينات على النحو الذي يحدده مقايسة لوري. ويمكن بعد ذلك عينات مرجعية المعدة باستخدام هذه الطريقة يمكن استخدامها في فتحة لطخة الكمي لمحتويات NA في عينات من مصل مصنعين اللقاحات.

  1. لمستضدات NA المرجعية وعينات اختبار لقاح : خفف من مستضد المرجعية NA الأسهم في 0.01 ٪ Zwittergent / TBS للتركيزات التالية : 0 ، 0.039 ، 0.078 ، 0.1562 ، 0.3125 ، 0.625 ، 1.25 ، 2.5 ، 5 و 10 ميكروغرام NA / مل. مزيج جيد. ثم تمييع عينات اختبار لقاح للاستعمال البشري التي تم الحصول عليها من المنتجين لقاح أو مصنوعة في المنزل لأغراض البحث العلمي في 0.01 ٪ Zwittergent / TBS وتخلط جيدا. بينما يمكن تشغيل التكرارات من مستضد المرجعية وعينات لقاح ، ويفضل triplicates. 3 تحضير التخفيفات من كل عينة (2 أضعاف الفرق) للسماح للتركيز العينة تقع ضمن منحنى القياسية. إعداد 450 أو 650 ميكرولتر ميكرولتر من كل مستضد أو إشارة اختبار تخفيف عينة لقاح لتشغيل مكررة أو triplicates على التوالي. ويمكن اختبار لقاحات الانفلونزا التكافؤ والطرافةح هذا الأسلوب لطخة الفتحة.

4. تجميع جهاز بيو دوت SF الدقيق والنشاف على عينات من الغشاء PVDF

  1. تجميع تنظيفها وتجفيفها قبل الدقيق SF بيو دوت اجهزتها. يتبع المركز لوحة الدعم طوقا في مشعب الفراغ ووضع الختم على top.Place طوقا على ورقة من 3 مبلل بيو دوت رقة الترشيح SF على مدى وحشية ، عن طريق الغشاء PVDF قبل غارقة. مكان القالب عينة على رأس الغشاء والإصبع تشديد المسامير الأربعة باستخدام نمط مائل عبور لضمان التطبيق الموحد للضغط على سطح الغشاء.
  2. تحقق من أن يتم تعيين صمام 3 وسيلة لفضح متعددة فراغ إلى فراغ المصدر الوحيد قبل تشغيل المضخة ويربط هذا الفراغ.
  3. تشغيل المضخات وأجهزة الاتصال بيو نقطة. تأكد من أن يتم وضع صمام تدفق عند مستوى أقل من الآبار عينة لمياه الصرف السريع والسليم للعينات في الخطوات التالية.
  4. كرر الخطوة تشديد المسمار باستخدام نمط مائل المعبر. تشديد الخناق في حين يتم تطبيق فراغ يضمن إحكام اغلاق ومنع التلوث المتبادل بين الآبار.
  5. تغيير صمام تدفق لفضح مشعب الفراغ في الهواء وإيقاف المضخة.
  6. تطبيق 100 ميكرولتر من TBS لجميع الآبار باستخدام pipettor الأقنية لترطيب الغشاء وبالتالي ضمان ملزم الموحد للمستضد. يجب توخي الحذر لتجنب تشكيل فقاعات ، وتطبيق الحل في منتصف البئر ، وأقرب إلى أسفل وقت ممكن ، من أجل تغطية فتحة بالتساوي. أي انفجار فقاعة الهواء قدم بالصدفه مع طرف pipettor.
  7. تغيير صمام تدفق لفضح متعددة إلى كل من الهواء والفراغ ، وتشغيل المضخة ، واستنزاف بلطف العازلة من الآبار عن طريق وضع الإصبع على الميناء تعرضها للهواء لتنظيم كمية من فراغ.
  8. تغيير صمام تدفق لفضح متعددة في الهواء حالما العازلة استنزفت تماما من جميع الآبار. إيقاف المضخة أو قطع الفراغ.
  9. 200 ميكرولتر من تطبيق كل معيار أو لقاح تخفيف عينة لكل بئر. الماصة عينات في وقت واحد ، في وسط كل بئر ، وأقرب إلى أسفل وقت ممكن ، مع الحرص على تجنب إدخال فقاعات الهواء. أي انفجار فقاعة الهواء قدم بالصدفه مع طرف pipettor. طرح 200 ميكرولتر من العازلة تخفيف العينة (اليوريا 4M / TBS أو 0.01 ٪ Zwittergent / TBS) في الآبار المستخدمة لضمان الفراغ المناسب للاستخدام في آبار.
  10. ضبط صمام تدفق لفضح متعددة إلى كل من الهواء والفراغ. بدوره على مضخة (أو إعادة فراغ) والسماح بلطف عينات لاستنزاف تماما من الآبار عن طريق التحكم في كمية من فراغ ، مع إصبع واحد على منفذ تعرضها للهواء. إزالة الإصبع من منفذ للافراج عن فراغ في أقرب وقت جميع العينات قد استنزفت.
  11. إضافة على الفور 200 ميكرولتر من TBS به إلى كل بئر pipettor الأقنية. تطبيق فراغ لطيف لاستنزاف الآبار ، ويغسل عن طريق التحكم في كمية الفراغ مع إصبع واحد على منفذ تعرضها للهواء.
  12. كرر الخطوة غسل موضح في الخطوة 4.11. حالما الآبار قد استنزفت تماما ، وتخفيف الخناق من قالب نموذج وإيقاف لتجنب فراغ overdrying الآبار. الشروع فورا في إزالة الغشاء.
  13. مكان الغشاء الى عرقلة العازلة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ، مع هزاز لطيف. حظر استخدام المخزن ما يكفي لتغطية كامل الغشاء.

5. Immunoblotting المستضدات HA و NA

  1. عقب بين عشية وضحاها في حضانة العازلة حظر غسل غشاء مرتين لمدة 5 دقائق مع TBS/0.1 ٪ توين - 20 العازلة الغسيل. لجميع الغسيل وحضانات ، وضمان مغطاة بالكامل الغشاء مع الحل.
  2. احتضان الغشاء مع الضد الأرنب العالمي ضد HA (مثل يوني - 1) أو NA (مثل HCA - 2 أو 3 - HCA) المخفف في 5 ٪ ث / ت جيش صرب البوسنة في غسل العازلة لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة ، مع طيف هزاز. تركيزات الضد الأمثل يجب أن يتم تحديد الأجسام المضادة لكل سهم. أعطى من التخفيفات 1:4000 من الأرانب المصل المضاد النتائج المثلى لالأضداد المذكورة أعلاه.
  3. يغسل الغشاء ثلاث مرات ، في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف لمدة 15 دقيقة كل مرة ، لإزالة أي أجسام مضادة غير منضم الابتدائي.
  4. احتضان الغشاء مع الأضداد المضادة للأرنب HRP - مترافق الثانوية. استخدام 1:50000 التخفيف من عنزة ImmunoPure الحرارية المضادة للأرنب IgG والأضداد البيروكسيديز مترافق في عرقلة العازلة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع هزاز لطيف.
  5. يغسل الغشاء ثلاث مرات ، هزاز لمدة 15 دقيقة كل مرة ، في درجة حرارة الغرفة العازلة مع الغسيل لإزالة أي أجسام مضادة غير منضم الثانوية.
  6. يغسل الغشاء مع TBS لمدة 5 دقائق مع هزاز لطيف لإزالة بقايا المنظفات توين - 20 من سطح الغشاء.
  7. تعد الركيزة مع 3 مل من كل صeagent من الغرب Supersignal دورا المدة الممتدة من عدة الركيزة العلمية الحرارية وتخلط جيدا.
  8. وضع غشاء على المناديل الورقية الجافة بلطف لإزالة أي العازلة TBS الزائدة.
  9. نقل الغشاء إلى حاوية الجافة وإضافة الركيزة لتغطية كامل الغشاء. احتضان 5 دقائق مع هزاز لطيف ، في درجة حرارة الغرفة.
  10. الركيزة إزالة الزائدة النشاف برفق على غشاء المناديل الورقية.
  11. تعرض غشاء لفيلم معان كيميائي. سوف طول التعرض الحاجة إلى أن يكون الأمثل لتجنب إشارة التشبع ولكن عادة ما تتراوح بين 10 ثانية الى 10 دقيقة.
  12. إجراء تحليلات كثافة على الفيلم تم تطويرها باستخدام جهاز التصوير هلام مثل وثائق نظام Fluorchem هلام (ألفا Innotech) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. وبلغ متوسط ​​كثافة ثم القيم لكل مجموعة من نسخ مكررة من المستضدات المرجعية وعينات اختبار لقاح. بينما يمكن تشغيل مستضد معايير ونماذج اللقاح في التكرارات ، ويفضل triplicates. وينبغي أن قيم الكثافة لتكون متماثلة متشابهة جدا. فروق ذات دلالة إحصائية بين مكررات تشير إلى وجود مشكلة فنية محتملة خلال هذه العملية. يتم إنشاء منحنى القياسية التي تعتمد على التركيز على القيم بالتآمر متوسط ​​الكثافة مقابل مبلغ (في نغ) من HA أو NA مستضد وضعت في كل فتحة من المعيار المرجعي. باستخدام المناسبة المناسب منحنى المعايرة المناعية في أمر بالغ الأهمية لقياس HA و NA بدقة. الانحدار الخطي ، التي حصل عليها المتهم بالتآمر في الاستجابة (ص) في مقابل تركيز (خ) باستخدام جزء من منحنى خطي ردا (ذ = متر + ب) هو أبسط طريقة لالكمي لanalytes. إذا كان يعتبر أوسع نطاقا من analytes لحساب التركيز ، ينبغي أن تستخدم لوجستية المعلمة الأربعة (4PL) نموذجا لالمناعية المقبولة حاليا. مجموعة متنوعة من البرامج المتوفرة للمحققين المهتمة للنظر فيها. في حالة فحص فتحة لطخة صفها ، وتحويل القيم محور س لتسجيل النطاق يسمح للمنحنى لتناسب نموذج 4 - PL واستخدام متغير الانحدار غير الخطية المنحدر لحساب كميات نشف من HA و NA في اختبار عينات لقاح أمر ممكن الآن. ونحن بالتالي استخدامها بشكل روتيني لهذا النموذج تحليلاتنا. كما تم تخفيفه عينات اختبار في أي لقاح اليوريا 4M / TBS أو 0.01 ٪ Zwittergent / TBS قبل أن نشف على الغشاء ، وعامل إضعاف لكل عينة تحتاج إلى أن تؤخذ بعين الاعتبار لتحديد محتوى وHA NA الاختبار الأصلي لقاح العينات. يقترح أن يتم تشغيل كل عينة اختبار اللقاح على ثلاث تخفيفات مختلفة (2 أضعاف الفرق) من أجل مجموعة واحدة من قيم الكثافة لتدخل في منحنى القياسية. قيم كثافة أعلى من النطاق المنحنى القياسي لجميع التخفيفات اختبار عينات من اللقاح بحاجة إلى مزيد من المخفف لدقيقة أو الكمي HA NA. إذا كانت القيم هي أقل كثافة أدنى نهاية المنحنى ، ينبغي تخفيف عينات الاختبار في انخفاض عامل التخفيف.

6. ممثل النتائج :

وأكدت التحليلات المعلوماتية الحيوية المتاحة لجميع الأنفلونزا A HA متواليات في N - محطة فرعية للHA2 (ببتيد والانصهار) والمنطقة الوحيدة المحفوظة هكتار. الشكل 1 يبين نسبة الحفظ لكل وظيفة من الأحماض الأمينية تسلسل الآراء التي تم تحديدها. وقد تم تحديد اثنين من الاختلافات في المواقف 2 (L -> I) و 12 (G -> N) من الأحماض N - 14 محطة الأمينية HA2 ، ولكن تم العثور على مثل هذه الاختلافات لا تؤثر على الربط بين الأضداد والمتغيرات الببتيد 6 . تم اختيار حاتمة يوني - 1 (GLFGAIAGFIEGGW) لتطوير الأجسام المضادة ضد HA عالمية. أظهرت هذه الأضداد النوعية الملحوظة لتسلسل الفيروسي ، وقادر على الربط إلى 13 فرعية مختلفة من HA A (H1 - H13) الأنفلونزا (الشكل 2).

باستخدام نهج مماثل ، تم التعرف على اثنين من متواليات الحفظ عالميا في جميع الأنفلونزا A NA ، واحدة بالقرب من موقع نشط إنزيمي (HCA - 2) (3A الشكل) والآخر في محطة - N (HCA - 3) (الشكل 3B) . وقد استخدمت هذه الببتيدات مع تسلسل الأحماض الأمينية ومضادات لتوليد أجسام مضادة ضد NA عالمية. كانت الأجسام المضادة ضد كل من الحواتم قادرة على ملزمة لجميع الأنواع الفرعية 9 من NA وأظهرت القليل جدا عبر التفاعل مع بروتينات السقاء أو الخلوية ، مما يدل على نوعية عالية للتسلسل الفيروسي NA (الشكل 4).

ويبين الشكل 5 لمحة عامة عن فتحة طريقة لطخة الكمي للHA و NA الأنفلونزا.

وترد أمثلة من HA و NA لطخة تحليل مستضد فتحة في أرقام 6 و 7. الرقم 6A 6C ويظهر النتائج ممثل بعد الكشف عن مستضد HA في اشارة القياسية لقاح الانفلونزا وعينات لقاح على التوالي. تم تشغيل كل عينة (قياسي أو لقاح) في نسختين ، في الآبار المجاورة. وينبغي أن تظهر التكرارات similaكثافات ص الكشف التالية. قد تكون هناك حاجة لتحسين التخفيفات الأضداد ، وحضانة زمن التعرض اعتمادا على الأجسام المضادة المستخدمة.

ويرد مثال نموذجي على مستوى منحنى حصلت في أعقاب الكشف عن تركيزات مختلفة من HA من معيار عينة لقاح 6B الإشارة في الشكل. تركيز المستضد HA غير متناسبة مع شدة الإشارة التالية الكشف عن معان كيميائي لطخة الفتحة وتناسبها نموذج منحنى 4 - PL المناسب لهذا النطاق التركيز (،0938-6 HA ميكروغرام / مل).

الشكل 7 يبين نتائج ممثل الكشف عن مستضد NA في اشارة القياسية لقاحات الأنفلونزا والعينات في اللقاح. وأظهر التحليل أن كثافة شدة الإشارة التي تم الحصول عليها عن طريق الكشف عن مستضد NA في التخفيفات مختلفة من لقاح المرجعية المعيارية التي صمة فتحة يتناسب مع تركيز NA (الشكل 7A). منحنى القياسية الناجمة يناسب نموذجا 4 - PL عن هذا النطاق التركيز (0،039 حتي 10 ميكروغرام NA / مل) ، كما هو مبين في الشكل 7B. ويبين الشكل 7C مثالا على فتحة لطخة تحليل مضمون NA في عينات لقاح الانفلونزا. وكان يعاير كل عينة في نسختين ، في الآبار المجاورة.

الشكل 1
الشكل 1. محافظة على معدل حاتمة يوني 1 الانصهار في المنطقة الببتيد هكتار والأنفلونزا.
المعلوماتية الحيوية لجميع التحليلات المتاحة الأنفلونزا A HA متواليات أكد أن الببتيد الانصهار (الموجود في نهاية - N من الوحيدات HA2) هي المنطقة الوحيدة المحفوظة عالميا HA. علما انه تم العثور على الاختلافات اثنين في موقف 2 (L -> I) و 12 (G -> N) لا تؤثر على الضد ملزمة 6. ووضعت الضد عالمية قادرة على ربط مختلف أنواع فرعية 13 ألف هكتار (H1 - H13) الأنفلونزا باستخدام يوني - 1 حاتمة (GLFGAIAGFIEGGW).

الشكل 2
الشكل 2. الكشف عن 13 أنواع فرعية من الأجسام المضادة التي كتبها HA HA العالمية لمكافحة.
نشر السوائل السقاء من 13 أنواع فرعية من فيروسات الانفلونزا في البيض المحتوي كانت مجزأة في SDS - PAGE ، ثم من خلال الكشف عن البروتينات HA باستخدام الأجسام المضادة عالمية ضد حاتمة يوني - 1 هكتار. تم الكشف عن البروتين وتحميل NP التحكم باستخدام أرنب النسائل المتعددة NP محددة الأجسام المضادة. وكان السقاء من البيض السائل المعافين -- السيطرة السلبية (). تم السيطرة الموجب (+) معيارا مرجع H1 من NIBSC ، المملكة المتحدة

الشكل 3
الشكل 3. تناظر تسلسل الانفلونزا A NA بالقرب من موقع نشط إنزيمي وصول N.
وقد تم تحديد اثنين من سلاسل عالميا في الحفاظ على الأنفلونزا A بواسطة NA المعلوماتية الحيوية ، واحدة تقع بالقرب من موقع نشط الأنزيمية (HCA - 2) (لوحة أ) ، والآخر في محطة - N (HCA - 3) (الفريق باء). وتوليفها مع هذه الببتيدات تسلسل الأحماض الأمينية حفظها واستخدامها لتوليد أجسام مضادة ضد NA عالمية.

الشكل 4
الشكل 4. الكشف عن 9 أنواع فرعية من الأجسام المضادة التي كتبها NA NA.
نشر من السوائل السقائي فرعية NA تسعة من فيروسات الأنفلونزا في البيض المحتوي كانت مجزأة في SDS - PAGE ، ثم من خلال الكشف عن البروتينات باستخدام HCA NA - 2 (لوحة أ) و 3 - HCA (لوحة B) الأجسام المضادة. تم الكشف عن البروتين وتحميل NP التحكم باستخدام أرنب النسائل المتعددة NP محددة الضد (لوحة C). وكان السقاء من البيض السائل المعافين -- السيطرة السلبية (). تم السيطرة الموجب (+) مع السائل السقائي ارتفعت rNA1 نظام عالمي جديد / Caledonia/20/99 وأمصال مضادة وضعوا المقابلة.

الشكل 5
الشكل 5. مخطط تدفق من فتحة الداخلي لطخة الكميات المستضدات HA و NA في لقاحات الانفلونزا.
مستعدون لأول مرة المخازن اللازمة لتخفيف العينة وكذلك لغسيل وحجب الغشاء فتحة وصمة عار في الغشاء PVDF وأوراق الترشيح اللازمة لتجميع جهاز بيو دوت الدقيق SF هي غارقة قبل. والمخفف لقاح الانفلونزا والعينات المرجعية المعيارية في مخازن الأمثل لHA NA أو الكشف عن طريق فتحة وصمة عار. يتم تجميعها في الدقيق SF بيو دوت جهاز وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ويتم تطبيقها على عينات من الغشاء PVDF. ويتم الكشف عن مستضدات HA NA باستخدام الأجسام المضادة ضد كل مستضد عالمية. يتم إجراء تحليل كثافة على الاشارات التي تم الحصول عليها لمعان كيميائي الكميات من HA و NA في العينات التي تم اختبارها.

الشكل 6
الشكل 6. الكشف عن مستضد HA في عينات لقاح الأنفلونزا وأشيرسينعقد القياسية.
لوحة ويظهر ممثل لطخة تم الحصول عليها بعد مناعي للمستضد HA. والمخفف للمستضد المرجعية HA لتركيزات 0-6 ميكروغرام كانت مخففة HA / مل واللقاحات اللازمة لتركيز 0.375 ميكروغرام HA / مل في اليوريا 4M / TBS قبل تطبيقها على غشاء PVDF مع جهاز بيو دوت الدقيق SF . تم الكشف عن مستضد ثم ها باستخدام الأجسام المضادة يوني - 1 العالمية. لوحة باء يظهر مثال على منحنى القياسية التي تم الحصول عليها عن طريق الكشف عن إشارات من تركيزات مختلفة من HA لقاح القياسية المرجعية. كثافة إشارة يتناسب مع تركيز HA ومنحنى يناسب نموذجا 4 - PL.

الشكل 7
الشكل 7. كشفها للمستضد NA في عينات لقاح الأنفلونزا والمعيار المرجعي.
الفريق A و B ممثل تظهر اشارات حصلت في أعقاب الكشف عن NA في اشارة القياسية لقاح الانفلونزا مخفف لتركيزات NA تتراوح من 0 إلى 10 ميكروغرام NA / مل في 0.01 ٪ Zwittergent / TBS وما ينجم عن ذلك المنحنى القياسي 4 - PL التالية تحليلات كثافة. ويرد مثال نموذجي الكشف عن إشارات لمعان كيميائي بعد فتحة تحليل لطخة من المستضد NA في عينات لقاح الانفلونزا في الفريق جيم عينات لقاح الأنفلونزا والمخفف لتركيز HA 1 ميكروغرام / مل في 0.01 ٪ Zwittergent / TBS وكان الصعود إلى نشف PVDF باستخدام الغشاء الدقيق SF بيو دوت اجهزتها. وقد أدرجت التخفيفات المعيار المرجعي لقاح المقابلة ، مع تركيزات تتراوح من 0 إلى 2.5 ميكروغرام NA / مل ، وصمة عار على نفسها من أجل إنشاء منحنى الكميات القياسية لللمستضد NA في العينات اللقاح. تم الكشف عن مستضد الضد مع NA - 2 HCA العالمية لمكافحة NA وتحليل كثافة من الحصول على اشارات لمعان كيميائي كان أداؤها. ويمكن حساب كمية NA في كل عينة لقاح ضد المنحنى القياسي 4 - PL التي حصل عليها المتهم بالتآمر في قيم الكثافة إشارة مقابل تركيز NA لقاح القياسية المرجعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحديد كمي لHA الأنفلونزا الفيروسية وNA بالغة الأهمية بالنسبة لبحوث اللقاحات والتنمية منذ هذه البروتينات السطحية هما أهم عناصر فيروسية حفز الاستجابات المناعية 6-11. الطرق المناعية ذكرت سابقا للكشف عن هذه البروتينات الأجسام المضادة تتطلب سلالة معينة. وصمة فتحة بسيطة ومتكررة وطريقة سريعة لتحديد المستضدات HA و NA الموصوفة هنا هي مناسبة لجميع فيروسات الإنفلونزا A HA وبروتين NA الأضداد منذ الاعتراف بها عالميا الحواتم فقط الحفظ 6-8. ربما لصعوبة الوحيد للمحققين المهتمة في هذا الأسلوب هو أن ليس لديهم مثل هذه الأجسام المضادة عالمية في المنزل. ومع ذلك ، وتوليد أجسام مضادة باستخدام هذه الببتيدات كما المستضدات هو إجراء روتيني. في حين أن العلماء المهتمين يمكن أن تجعل من نفسها الأجسام المضادة وفقا للإجراءات المبينة لأن المتغيرات الببتيدات تتنافس ايضا على قدم المساواة فيما بينها من أجل الربط إلى ببتيد معين في ELISA التنافسية 6-8 ، فإنها قد اتصل أيضا للكتاب والأضداد HA NA أن تكون المستخدمة في أبحاثهم استكشافية.

بقدر ما يتعلق الأمر فحص لطخة فتحة ، فإنه واضح ومباشر نوعا ما ، مع إيلاء اهتمام خاص في حاجة إلى خطوات قليلة فقط ، كما هو موضح أعلاه. على الرغم من أن كلا HA و NA يتم الكشف في العينات غير المعالجة ، وتحققت زيادة الحساسية من العلاج الأولي للعينات.

على الرغم من مزاياها السرعة والبساطة واستنساخ ، وصمة عار عالمي يستند إلى فتحة الضد الأساليب المذكورة هنا على قيود معينة. على سبيل المثال ، ليست مصممة لتمييز أو فرعية مختلفة HA NA وعلى هذا النحو ، ربما تكون أكثر ملاءمة لو / في عملية مراقبة الجودة أو تحليلات اللقاح الأحادي التكافؤ من الاستعدادات. في مقايسة SRID يبقى في ذلك طريقة اختيار لتحديد الأنواع الفرعية من HA في لقاحات الأنفلونزا الفيروسية 3.

باختصار ، تم تحديد تسلسل للغاية في الحفاظ HA و NA لتوليد أجسام مضادة أحادية محددة ، والتي يمكن استخدامها لتحليل الكمي للسلالات تقريبا أي من الأنفلونزا الفيروسية HA و NA. بينما قدم لطخة فتحة مفصلة الإجراء مع هذه الأجسام المضادة العالمية لمكافحة HA و NA هنا ، يمكن للمحققين المهتمة استخدامها كأداة البحوث الأساسية في أنواع أخرى من المناعة ، نظرا لأنها أثبتت خصوصية ملحوظة ضد تسلسل الفيروسي دون اكتشافها عبر التفاعل مع السقائي أو البروتينات الخلوية. أيضا نلاحظ أن الأجسام المضادة العالمية لمكافحة HA HA يمكن الكشف عن الأم في التشكل في مزارع الخلايا المصابة بالفيروسات 12 ، الذي يسلط الضوء على مجموعة واسعة من التطبيقات لهذه الأجسام المضادة كأدوات للبحوث الأساسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر السيدة مونيكا Tocchi لمراجعة تحريرية للمخطوطة. ويدعم AMH بواسطة منحة من جامعة الملك عبدالعزيز ، عن طريق المكتب الثقافي السعودي في كندا العربي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus Bio-Rad 170-6542
Bio-Dot SF Filter paper Bio-Rad 162-0161
Immobilon-FL transfer membrane (PVDF) EMD Millipore IPFL00010
Vacuum pump EMD Millipore WP6111560
Chemiluminescence BioMax Light Film Kodak 178 8207
FluorChem Gel Documentation System Alpha Innotech 29-008-1896X
Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens Uni-1 (HA)HCA-2, HCA-3 (NA) Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7.
Influenza vaccine reference antigen CBER/FDA or NIBSC
Influenza vaccine samples Commonly available in most countries
Urea Sigma-Aldrich U1250
Zwittergent 3-14 Detergent Calbiochem 693017
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk Bio-Rad 170-6404
ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated Thermo Fisher Scientific, Inc. 31460
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate Thermo Fisher Scientific, Inc. 34075

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Webster, R. G., Bean, W. J. Genetics of influenza virus. Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).
  2. Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).
  3. Wood, J. M. The influence of the host cell on standardisation of influenza vaccine potency. Dev Biol Stand. 98, 183-188 (1999).
  4. Sylte, M. J., Suarez, D. L. Influenza neuraminidase as a vaccine antigen. Curr Top Microbiol Immunol. 333, 227-241 (2009).
  5. Bright, R. A., Neuzil, K. M., Pervikov, Y., Palkonyay, L. WHO meeting on the role of neuraminidase in inducing protective immunity against influenza infection. Vaccine. 27, 6366-6369 (2008).
  6. Chun, S. Universal antibodies and their applications to the quantitative determination of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins. Vaccine. 26, 6068-6076 (2008).
  7. Gravel, C. Qualitative and quantitative analyses of virtually all subtypes of influenza A and B viral neuraminidases using antibodies targeting the universally conserved sequences. Vaccine. 28, 5774-5784 (2010).
  8. Li, C. A simple slot blot for the detection of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins using universal antibodies targeting the fusion peptide. Nat Protoc. 5, 14-19 (2010).
  9. Harvey, R., Wheeler, J. X., Wallis, C. L., Robertson, J. S., Engelhardt, O. G. Quantitation of haemagglutinin in H5N1 influenza viruses reveals low haemagglutinin content of vaccine virus NIBRG-14 (H5N1). Vaccine. 26, 6550-6554 (2008).
  10. Li, C. Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China. Biologicals. 38, 284-289 (2010).
  11. Johansson, B. E., Pokorny, B. A., Tiso, V. A. Supplementation of conventional trivalent influenza vaccine with purified viral N1 and N2 neuraminidases induces a balanced immune response without antigenic competition. Vaccine. 20, 1670-1674 (2002).
  12. Hashem, A. Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus. Biochem Biophys Res Comm. , Forthcoming (2010).

Tags

علم المناعة ، العدد 50 ، الفيروسات والأنفلونزا وراصة دموية ، النورامينيداز ، الكمي ، الأجسام المضادة عالمية

Erratum

Formal Correction: Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays
Posted by JoVE Editors on 11/13/2012. Citeable Link.

An author's affiliation was omitted from the publication of Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. A third affiliation was added for Anwar M. Hashem:

Microbiology Department, Faculty of Medicine, King Abdulaziz University

نوع التحاليل الكمية للجميع الأنفلونزا من Hemagglutinins الفيروسية وNeuraminidases باستخدام الاجسام المضادة العالمي في فتحة بسيطة فحوصات لطخة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gravel, C., Li, C., Wang, J.,… More

Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., He, R., Li, X. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), e2784, doi:10.3791/2784 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter