Количественный анализ всех гриппа типа Вирусный Hemagglutinins и нейраминидазы использованием универсального антител в простом Анализы Blot Слот

Summary

Простой метод блот слот был разработан для количественной оценки гриппа вирусного гемагглютинина и нейраминидазы с использованием универсальных антител ориентации их наиболее сохраняется последовательности, выявленных в ходе анализа биоинформатики. Этот инновационный подход может обеспечить полезную альтернативу количественное определение всех вирусных гемагглютинина и нейраминидазы.

Protocol

1. Приготовление реагентов и оборудования

1. Перед началом процедуры слот-блот, подготовить 20_mls 4 М раствор мочевины в трис-буферный солевой раствор (20 мМ Tris, 137 мМ NaCl, рН 7,6) (TBS) для гемагглютинин или HA, слот пятно, или 20_mls от 0,01% Zwittergent решение в TBS для нейраминидазы или НД, слот пятно. Хотя 4M мочевины следует приготовить свежую каждый раз, 10% Zwittergent маточного раствора в дН ₂ O стабилен в течение не менее 6 месяцев при комнатной температуре и поэтому может быть разбавлен до 0,01% в TBS перед каждым анализом.
2. Подготовка 2000 мл промывочного буфера, добавив Твин-20, чтобы решение TBS до конечной концентрации 0,1%. Подготовка 80 мл блокирующего буфера путем растворения обезжиренное сухое молоко (промокательной сорт сухого обезжиренного молока) до конечной концентрации 5% вес / в стиральных буфера.
3. Активировать PVDF мембраны (нарезанные на 9 х 12 см, размер) в метаноле в течение 15 секунд, а затем 2 минуты промыть в DDH ₂ O. Замочите мембраны в TBS до использования. Предварительно мокрой 3 листа Био-Dot SF фильтровальную бумагу в TBS, пока используется.

2. Подготовка вакцины против гриппа образцы и эталон для ГК слот пятно

Вакцина против гриппа эталонов с заранее заданными HA содержание соответствующих вакцинных штаммов для тестирования были получены из Центра биопрепаратов оценке и исследованиям (СБЕР / FDA, США) и Национального института биологических Стандартные и контроля (NIBSC, Великобритания) и используются для количественного HA по слотам пятно. Следователи также могут подготовить свои собственные стандарты антигена с использованием установленных процедур, как описано в ссылках 9 и 10.

1. Для HA ссылкой антигенов и тестовых образцов вакцины: Развести антиген HA ссылкой акций 4M мочевины / TBS в следующих концентрациях: 0, 0,0938, 0,1875, 0,375, 0,75, 1,5, 3 и 6 мкг HA / мл. Хорошо перемешайте. Затем, развести испытания вакцины образцы для человека получить вакцину производителей или собственного производства научно-исследовательских целях в 4M мочевины / TBS и хорошо перемешать. Хотя дубликаты антиген ведения и образцы вакцины может быть запущен, трем образцам являются предпочтительными. Подготовка 3 разведений каждого образца (2-кратное различие), чтобы образец концентрации, чтобы подпадать под стандартной кривой. Подготовка 450 мкл или 650 мкл каждого антигена ссылки или испытание вакцины разведения образцов для запуска дубликаты или трем образцам соответственно. Моновалентная гриппа вакцины могут быть проверены с помощью этого метода пятно слот. Содержание ГК ссылкой антигенов ранее определяли с помощью SRID который в настоящее время используется стандартный тест для подготовки вакцины против гриппа. Содержание HA определяется SRID была использована в качестве исходной ссылкой антиген фондовом HA концентрации для подготовки разведений для слота пятно стандартной кривой.

3. Подготовка вакцины против гриппа образцы и эталон для Н. А. слот пятно

Вакцина против гриппа эталонов соответствующих вакцинных штаммов для тестирования были получены из Центра биопрепаратов оценке и исследованиям (СБЕР / FDA, США) и Национального института биологических Стандартные и контроля (NIBSC, Великобритания) и используются для количественного Н.А. по слотам пятно. Содержание НС этих контрольных образцов определяли по SDS-PAGE анализа deglycosylated образцов в сочетании с денситометрии сканирования анализ, как описано выше ^9, с небольшими изменениями ^10. Короче говоря, deglycosylated вакцины контрольных образцов (5 мкг) смешивали с образцами буфера и погружены на гель. Гель работать при токе 20 мА в течение примерно 90 мин, пока отслеживания красителя просто запустить из геля, а затем окрашивание Sypro. Денситометрии количественного белков было проведено с использованием документации Fluorchem гелевой системы (Альфа Иннотек). Количество Н.А. была определена на основе соотношения белков НС общего белка, как это определено анализа Лоури. Ссылка образцах, изготовленных с помощью этого метода можно использовать в слоте пятном для количественной оценки содержания НС в вакцины образцы вакцины производителям.

1. Для Н. А. ссылкой антигенов и тестовых образцов вакцины: Развести антиген Н. А. ссылкой акции в 0,01% Zwittergent / TBS в следующих концентрациях: 0, 0,039, 0,078, 0,1562, 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5 и 10 мкг NA / мл. Хорошо перемешайте. Затем, развести испытания вакцины образцы для человека получить вакцину производителей или собственного производства научно-исследовательских целях в 0,01% Zwittergent / TBS и хорошо перемешать. Хотя дубликаты антиген ведения и образцы вакцины может быть запущен, трем образцам являются предпочтительными. Подготовка 3 разведений каждого образца (2-кратное различие), чтобы образец концентрации, чтобы подпадать под стандартной кривой. Подготовка 450 мкл или 650 мкл каждого антигена ссылки или испытание вакцины разведения образцов для запуска дубликаты или трем образцам соответственно. Моновалентная гриппа вакцин может быть проверена остроумияч этот метод слот пятно.

4. Ассамблея Био-Dot SF аппарата Микрофильтрация и промокательной образцов на PVDF мембраны

1. Соберите предварительно очищенные и высушенные Био-Dot SF Микрофильтрация аппарата. Место пластины Прокладка поддержки в вакуумном коллекторе и место уплотнительную прокладку на top.Place 3 смоченной листов Био-Dot SF фильтровальную бумагу за прокладку, после чего предварительно пропитанных мембран PVDF. Место пример шаблона в верхней части оболочки и пальцами затяните четыре винта с диагональной пересечения шаблон для обеспечения единообразного применения давления на поверхности мембраны.
2. Убедитесь, что 3-ходовой клапан установлен подвергать вакуумной многообразия источником вакуума лишь перед включением насоса и подключения вакуума.
3. Включите насос и подключиться к био-Dot аппарата. Убедитесь, что поток клапан находится на уровне ниже образец скважин для быстрого и надлежащего дренажа образцов в следующих шагах.
4. Повторите винт затяжки шаг, используя диагональные пересечения узор. Затяжки винтов в то время как вакуум применяется обеспечивает жесткий уплотнение и предотвращает перекрестное загрязнение между скважинами.
5. Изменение потока клапана подвергать вакуумного многообразия в воздух и выключить насос.
6. Применяют по 100 мкл TBS для всех скважин с помощью многоканальной пипетки, чтобы увлажняет мембраны обеспечивая таким образом равномерное связывание антигена. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать образования пузырьков и применять решение в середине хорошо, как можно ближе к нижней насколько это возможно, для того, чтобы покрыть слот равномерно. Съемки любой воздушный пузырь случайно ввел с пипетки чаевые.
7. Изменение потока клапана раскрыть многообразие как воздух и вакуум, включить насос, и аккуратно слить буфер из скважин, положив палец на порт на воздухе, чтобы регулировать количество вакуума.
8. Изменение потока клапана раскрыть многообразие в воздух, как только буфер полностью слита из всех лунок. Выключите насос и не отключайте вакуум.
9. Применить 200 мкл каждого стандарта или разбавления вакцины образца в каждую лунку. Внесите образцы по одному за раз, в центре каждой лунки, как можно ближе к нижней насколько это возможно, заботясь, чтобы избежать введения пузырьков воздуха. Съемки любой воздушный пузырь случайно ввел с пипетки чаевые. Положите 200 мкл разведения образцов буфер (4M мочевины / TBS или 0,01% Zwittergent / TBS) в неиспользуемых скважин для обеспечения надлежащего вакуума скважин в использовании.
10. Отрегулируйте клапаном подвергать многообразия как воздушных, так и вакуум. Включите насос (или восстановить вакуум) и мягко позволяют образцы полностью вытечь из скважин, контролируя количество вакуумных одним пальцем через порт контакте с воздухом. Удалить палец из порта, чтобы освободить вакуум, как только все образцы исчерпан.
11. Сразу же добавить 200 мкл TBS в каждую лунку помощью многоканальной пипетки. Применить нежная вакуума процедить и мыть скважин, контролируя количество вакуумных одним пальцем через порт контакте с воздухом.
12. Повторите шаг мыть, описанных в пункте 4.11. Как только скважины полностью разряжен, ослабьте винты пример шаблона и выключить вакуум, чтобы избежать пересушивания скважин. Немедленно принять меры для исключения мембраны.
13. Место мембрану в блокирующем буфере и инкубировать в течение ночи при 4 ° С, с нежным качалки. Используйте достаточно блокирующего буфера, чтобы полностью покрыть мембрану.

5. Иммуноблоттинг ГК и Н. А. антигенов

1. После инкубации в течение ночи в блокирующем буфере, мыть мембраны дважды в течение 5 минут с TBS/0.1% Твин-20 промывочным раствором. Для всех стирок и инкубации, убедитесь, мембрана полностью покрыта раствором.
2. Инкубируйте мембраны с универсальным антител кролика против HA (например, Uni-1) или Анонимных Наркоманов (например, HCA-2 или HCA-3) разводят в 5% вес / BSA в стиральных буфера в течение одного часа при комнатной температуре, с нежным качалки. Оптимальная концентрация антител, должны быть определены для каждого антитела акций. Растворы 1:4000 кролика анти-сыворотки дал оптимальные результаты для вышеупомянутых антител.
3. Вымойте мембраны в три раза, при комнатной температуре с нежным качалке в течение 15 минут каждый раз, для удаления несвязанного первичных антител.
4. Инкубируйте мембраны с HRP-сопряженных анти-кролик вторичными антителами. Используйте 1:50000 разведение коз Thermo ImmunoPure анти-IgG кролика, пероксидазы конъюгированных антител в блокирующем буфере и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут с нежным качалки.
5. Вымойте мембраны в три раза, покачиваясь в течение 15 минут каждый раз, при комнатной температуре промывочным буфером для удаления несвязанного вторичных антител.
6. Вымойте мембраны с TBS в течение 5 минут с нежным качалка для удаления остатков Твин-20 моющего средства от поверхности мембраны.
7. Подготовка субстрата с 3 мл каждого гeagent от Supersignal Запад Дура расширенный комплект Субстрат Продолжительность от Thermo Scientific и хорошо перемешать.
8. Место мембраны на сухую бумажную салфетку, чтобы аккуратно удалите излишки буфера TBS.
9. Передача мембраны сухую емкость и добавить подложку, чтобы покрыть всю мембрану. Выдержите 5 минут с нежным раскачивание, при комнатной температуре.
10. Удалите избыток субстрата, аккуратно промокательной мембрана на тонкой папиросной бумаге.
11. Expose мембраны хемилюминесценции фильма. Длина экспозиции должны быть оптимизированы, чтобы избежать насыщения сигнала, но обычно находится в пределах от 10 секунд до 10 минут.
12. Выполните денситометрии анализы на проявленной пленки использованием аппарата гель визуализации, таких как документация Fluorchem гелевой системы (Альфа Иннотек) в соответствии с инструкциями производителя. Значений плотности для каждого набора реплик ссылкой антигенов и тестовых образцов вакцины затем усредняются. Хотя антиген стандарты и образцы вакцины могут быть запущены в двух экземплярах, трем образцам являются предпочтительными. Плотность значения для репликации должны быть очень похожи. Значительные различия между повторяет указывают вероятные технические проблемы во время процедуры. Зависит от концентрации стандартной кривой устанавливается путем построения усредненных значений плотности от суммы (в нг) ГК или Н. А. антиген положить в каждую ячейку, от эталонного стандарта. Используя соответствующие установки калибровочной кривой в иммунологических имеет решающее значение для количественной HA и NA точно. Линейная регрессия, полученные путем построения ответа (у) в зависимости от концентрации (х) с использованием линейного участка кривой отклика (у = тх + б) простой метод для количественного определения аналитов. Если широкий спектр аналитов считается для концентрации расчета, четыре параметра логистики (4PL) модель для иммунологических принятых в настоящее время должны быть использованы. Разнообразное программное обеспечение доступно для заинтересованных исследователей, чтобы рассмотреть. В случае описанного блоттинга слот, преобразование оси абсцисс значения в логарифмическом масштабе позволяет кривую в соответствии с 4-PL модели и использование переменной склоне нелинейной регрессии для расчета уничтожены количества HA и NA в испытанных образцов вакцины, таким образом, это возможно. Поэтому мы регулярно использовать эту модель для нашего анализа. Как тестовых образцов вакцины разводят в любом 4M мочевины / TBS или 0,01% Zwittergent / TBS до того, как уничтожены на мембране, коэффициент разбавления для каждого образца должны быть приняты во внимание для определения HA и NA содержание первоначального испытания Вакцина образцов. Предполагается, что каждый образец испытания вакцины будет работать на трех различных разведениях (2-кратное различие), чтобы для одного набора значений плотности, чтобы подпадать под стандартной кривой. Плотность ценности выше, чем стандартный диапазон кривой для всех протестированных разведения вакцины образцы необходимо разбавить для точного HA и NA количественной оценке. Если плотность значения ниже самого низкого конца кривой, образцы следует развести по более низкой фактор разведения.

6. Представитель Результаты:

Биоинформатика анализ всех доступных гриппа HA последовательностей подтвердил N-конце HA2 субъединицы (слияние пептид), как только консервативная область ГК. На рисунке 1 показана сохранения скорости для каждого положении аминокислоты выявленных консенсусной последовательности. Два варианта были определены в положениях 2 (L-> I) и 12 (G-> N) из 14 N-концевых аминокислот HA2, но такие изменения были признаны не влияют на связь между антителами и пептидных вариантов ⁶ . Uni-1 эпитопа (GLFGAIAGFIEGGW) была выбрана для разработки универсальных антител против ГА. Это антитело продемонстрировали замечательную специфичность для вирусных последовательностей и способен связывать до 13 различных подтипов гриппа HA (H1-H13) (рис. 2).

Используя аналогичный подход, два универсальных сохраняется последовательности были идентифицированы у всех грипп, Н. А. одна близко к ферментативно активный центр (HCA-2) (рис. 3а), а другой на N-конце (HCA-3) (рис. 3б) . Пептиды с этими аминокислотных последовательностей использовали в качестве антигенов для создания универсальных антител к NA. Антитела против обоих эпитопы, способные связываться с все 9 подтипов НА и показали очень мало перекрестная реактивность к аллантоисную или клеточных белков, что свидетельствует о высокой специфичностью в отношении вирусных последовательностей Н. А. (рис. 4).

На рисунке 5 показан обзор методов слот пятном для количественной оценки гриппа HA и NA.

Примеры HA и NA антиген слот-блот-анализа показаны на рисунках 6 и 7. Рис 6A и 6C показывает, представитель результаты после обнаружения HA антигена в ссылку гриппа стандартные вакцины и вакцины образцов соответственно. Каждый образец (стандартный или вакцины) был запущен в двух экземплярах, в соседних скважинах. Дубликаты должны показать similaГ интенсивности после обнаружения. Оптимизация антител разведения, инкубации и время экспозиции может потребоваться в зависимости от антител используется.

Пример типичной стандартной кривой, полученной после выявления различных концентрациях ГК из стандартного образца ссылкой вакцина показана на рисунке 6B. Концентрации антигена HA пропорциональна интенсивности сигнала следующие хемилюминесценции обнаружения слот пятно и соответствует 4-PL подгонки кривой модель этого диапазона концентраций (0,0938 до 6 мкг HA / мл).

Рисунок 7 показывает, представитель результатов обнаружения антигена НС в эталон вакцины против гриппа и вакцин образцов. Плотность анализ показал, что интенсивность сигнала, полученного путем обнаружения антигена Н. А. в различных разведений стандартной вакциной ссылкой на слот пятно пропорциональна концентрации NA (рис. 7а). В результате стандартной кривой соответствует 4-PL модель этого диапазона концентраций (0,039 до 10 мкг NA / мл), как показано на рисунке 7B. Рис 7C показан пример анализа слот-блот-НС в содержании образцов вакцины против гриппа. Каждый образец анализировали в двух экземплярах, в соседних скважинах.

Рисунок 1. Сохранение скорости Uni-1 эпитопа в районе слияния пептида гриппа HA.
Биоинформатика анализ всех доступных гриппа HA последовательностей подтвердил, что слияние пептид (расположен на N-конце HA2 подразделения) является единственным универсальным консервативной области ГК. Обратите внимание, что две вариации в положении 2 (L-> I) и 12 (G-> N) было установлено, не влияют на антитела ^6. Универсальных антител, способных связываться 13 различных подтипов гриппа HA (H1-H13) был разработан с использованием Uni-1 эпитопа (GLFGAIAGFIEGGW).

Рисунок 2. Обнаружение 13 подтипов HA всеобщим антител против ГА.
Аллантоисной жидкости из 13 подтипов вируса гриппа А распространяется в куриных эмбрионов фракционировали в SDS-PAGE, после обнаружения HA белков, используя универсальные антитела против Uni-1 эпитопа ГК. Н. П. белок был обнаружен как загрузка управления с использованием поликлональных кролика NP-специфических антител. Отрицательный контроль (-) была аллантоисной жидкости из незараженных яиц. Положительный контроль (+) была ссылка стандарт Н1 от NIBSC, Великобритания

Рисунок 3. Последовательности гомологии гриппа Н. А. возле ферментативно активного центра и N-конца.
Два универсально сохраняется последовательности были выявлены при гриппе парламента Армении по биоинформатике, один из которых расположен рядом ферментативных активного центра (HCA-2) (группы), другие на N-конце (HCA-3) (группа Б). Пептиды с этим сохраняется аминокислотных последовательностей были синтезированы и используются для создания универсальных антител к NA.

Рисунок 4. Обнаружение 9 подтипов NA NA антителами.
Аллантоисной жидкости из девяти подтипов НА вируса гриппа А распространяется в куриных эмбрионов фракционировали в SDS-PAGE, после обнаружения белков Н. А. использования HCA-2 (группа А) и HCA-3 (группа B) антител. Н. П. белок был обнаружен как загрузка управления с использованием поликлональных кролика NP-специфических антител (Группа С). Отрицательный контроль (-) была аллантоисной жидкости из незараженных яиц. Положительный контроль (+) был аллантоисной жидкости подсыпали rNA1 А / Новая Caledonia/20/99 и исследовали с соответствующей сыворотки.

Рисунок 5. Блок-схема процедуры пятно слот для количественного определения HA и NA антигенов в противогриппозных вакцин.
Буферов необходимо для разведения образцов, а также для мытья и блокирование мембраны слот пятно сначала подготовить и PVDF мембраны и фильтра документы, необходимые для сборки Био-Dot аппарата микрофильтрации SF предварительно пропитанной. Вакцина против гриппа и эталонных образцов стандартных разводят в оптимальном буферов для HA и NA обнаружения слот пятно. Био-Dot SF микрофильтрации аппарат собран в соответствии с инструкциями изготовителя и образцов применяются на мембрану PVDF. HA и NA антигены обнаружены с помощью универсальных антител против каждого антигена. Денситометрии анализ проводится по хемилюминесценции сигналов, полученных для количественного определения HA и NA в тестируемых образцах.

Рисунок 6. Обнаружение HA антигена в образцах вакцины против гриппа и обратитесьENCE стандарта.
Группа показывает, представитель пятно получены следующие иммунодетекции антигена HA. Антигена HA ссылкой разбавляют до концентрации от 0 до 6 мкг HA / мл и вакцин разбавляют до концентрации 0,375 мкг HA / мл в 4M мочевины / TBS лишь после этого используются мембраны PVDF с Био-Dot аппарата микрофильтрации SF . Антигена HA тогда обнаружены с помощью Uni-1 универсальный антител. Группа B показывает пример стандартной кривой, полученной путем обнаружения сигналов различной концентрации ГК из эталона вакцины. Интенсивность сигнала пропорциональна концентрации ГК и кривая соответствует 4-PL модели.

Рисунок 7. Обнаружение антигена НС в вакцины против гриппа образцов и эталонного стандарта.
Группа А и В показывают, представитель сигналов, полученных после обнаружения НС в ссылку вакцины против гриппа стандартных разбавляют до Н. А. концентрациях от 0 до 10 мкг NA / мл в 0,01% Zwittergent / TBS и в результате 4-PL стандартной кривой следующие денситометрии анализов. Примером типичного сигналы хемилюминесценции выявлена ​​после анализа слот-блот-антиген Н. А. в образцах вакцины против гриппа показана в панели образцов C. Вакцина против гриппа разбавляли до концентрации 1 мкг HA / мл в 0,01% Zwittergent / TBS и были уничтожены на PVDF мембраны использованием Био-Dot SF микрофильтрации аппарата. Растворы соответствующего эталона вакцины, в концентрациях от 0 до 2,5 мкг NA / мл, были включены в тот же пятно с целью установления стандартной кривой для количественного определения антигена НС в вакцине образцов. Антиген Н. был обнаружен с HCA-2 универсальных антител против Н. А., денситометрия анализа сигналов, полученных хемилюминесценции была выполнена. Количество НС в каждой вакцины образец может быть рассчитана на 4-PL стандартной кривой, полученной путем построения значений интенсивности сигнала от концентрации НС за эталон вакцины.

Discussion

Количественное определение вирусной гриппа HA и NA имеют решающее значение для исследований и разработки вакцины, так как эти две поверхностные белки являются наиболее важными компонентами вирусной вызывать иммунный ответ ^6-11. Ранее сообщалось, иммунологические методы обнаружения этих белков требуется напряжение специфических антител. Простой, воспроизводимой и быстрый метод слот пятно количественно HA и NA антигены, описанные здесь, подходит для всех гриппа вирусного HA и NA белков с антителами признать их только универсально сохраняется эпитопов ^6-8. Единственная трудность для исследователей интересует этот метод может быть то, что у них нет таких универсальных антител в доме. Тем не менее, поколение этих антител использованием пептидов в качестве антигенов является рутинной процедурой. Хотя заинтересованные ученые могут сделать антитела сами в соответствии с процедурами, описанными потому что вариантов пептидов конкурировать одинаково хорошо между собой за связывание с данной пептида в конкурентный ИФА ^6-8, они также могут связаться с авторами для HA и NA антител к , используемых в их поисковых исследований.

Что же касается анализа слот пятно, то она довольно проста, при этом особое внимание необходимо только на несколько шагов, как описано выше. Хотя HA и NA оба могли быть обнаружены в необработанных образцах, повышенная чувствительность была достигнута предварительная обработка проб.

Несмотря на свои преимущества простоты, быстроты и воспроизводимость, универсальный на основе антител слот пятно методы, описанные здесь, имеют определенные ограничения. Например, они не предназначены для выделения различных HA или NA подтипов и как таковые, возможно, более пригодны для в процессе контроля качества и / или анализа одновалентных вакцинных препаратов. SRID анализа, следовательно, остается методом выбора для выявления подтипов HA вирусных вакцин в ^3.

Короче говоря, хорошо сохранились и последовательности в ГА и НА были отобраны для создания моно-специфические антитела, которые могут быть использованы для количественного анализа практически любого штамма гриппа, вирусного HA и NA. Хотя детальная процедура пятно слот с этим универсальным антител против ГА и НА представлена ​​здесь, заинтересованные исследователи могли использовать их в качестве основного инструмента исследования в других видах иммуноферментный анализ, учитывая, что они продемонстрировали замечательную специфику против вирусных последовательностей без выявляемых перекрестной реактивности с аллантоисную или клеточных белков. Также следует отметить, что универсальные антитела против HA HA может обнаружить в нативной конформации в инфицированных вирусом культуры клеток ^12, в котором освещается широкий круг применения этих антител в качестве основных инструментов исследования.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus	Bio-Rad	170-6542
Bio-Dot SF Filter paper	Bio-Rad	162-0161
Immobilon-FL transfer membrane (PVDF)	EMD Millipore	IPFL00010
Vacuum pump	EMD Millipore	WP6111560
Chemiluminescence BioMax Light Film	Kodak	178 8207
FluorChem Gel Documentation System	Alpha Innotech	29-008-1896X
Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens		Uni-1 (HA)HCA-2, HCA-3 (NA)	Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7.
Influenza vaccine reference antigen	CBER/FDA or NIBSC
Influenza vaccine samples			Commonly available in most countries
Urea	Sigma-Aldrich	U1250
Zwittergent 3-14 Detergent	Calbiochem	693017
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk	Bio-Rad	170-6404
ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated	Thermo Fisher Scientific, Inc.	31460
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	34075