הכנת מבודדים תאים חיים בעלי חוליות photoreceptor עבור דימות פלואורסצנטי

Summary

השיטה מתוארת להכנת יחיד photoreceptor תאים חיים ממינים שונים חוליות דימות פלואורסצנטי. השיטה יכולה לשמש התמונה פלואורסצנציה של fluorophores אנדוגני, כגון NADH או ויטמין A, או של exogenously צבעי ניאון הוסיף רגיש Ca

Abstract

ברשתית החוליות, phototransduction, ההמרה של האור לאות חשמלי, מתבצעת על ידי מוט חרוט תאים photoreceptor ^1-4. Photoreceptors רוד אחראים ראייה באור עמום, חרוטים על רקע בהיר. Phototransduction מתרחש במגזר החיצוני של התא photoreceptor, תא מיוחד המכיל ריכוז גבוה של פיגמנט ויזואלי, גלאי אור ראשוני. פיגמנט ויזואלי מורכב chromophore, 11 - ציס רשתית, מחובר לחלבון, opsin. פוטון נספג על ידי פיגמנט הראייה isomerizes chromophore מ 11 - ציס לכל, טרנס. Photoisomerization זה מביא לשינוי קונפורמציה פיגמנט הראייה כי יוזם מפל של תגובות שהגיעו לשיאן שינוי פוטנציאל הממברנה, ולהביא על התמרה של גירוי האור לאות חשמלי. ההתאוששות של התא מפני גירוי האור כולל את שחרור משרות של ביניים מופעל על ידי אור, ואת כינונה מחדש של פוטנציאל הממברנה. Ca ^{2 +} מודולציה את הפעילות של כמה אנזימים המעורבים phototransduction, וריכוז שלה הוא מופחת על גירוי אור. בדרך זו, Ca ^{2 +} משחק תפקיד חשוב בתהליך ההחלמה של התא מפני גירוי האור והתאמתה אור רקע.

עוד חלק חיוני של תהליך ההחלמה הוא התחדשות של פיגמנט הראייה כי הושמד במהלך איתור לאור על ידי photoisomerization של 11 שלה - chromophore לכל cis-trans ^5-7. התחדשות זה מתחיל עם שחרורו של טרנס כל הרשתית על ידי הפיגמנט photoactivated, והותיר אחריו opsin apo-החלבון. שוחררו כל טרנס רשתית מצטמצם במהירות התגובה לכל ניצול NADPH-טרנס רטינול, ו opsin משלב עם 11 טרי - רשתית cis להכניס קטע החיצוני לרפורמה פיגמנט הראייה. כל trans-רטינול הוא הועבר לאחר מכן מתוך קטע החיצוני לתוך תאים שכנים על ידי חלבון retinoid התמחה Interphotoreceptor המוביל הכבילה (IRBP).

דימות פלואורסצנטי של תאים photoreceptor יחיד יכול לשמש כדי ללמוד הפיזיולוגיה שלהם ביולוגיה של התא. Ca ^{2 +} רגיש צבעי ניאון ניתן להשתמש כדי לבחון בפירוט את יחסי הגומלין בין קטע החיצוני Ca ^{2 +} שינויים בתגובה האור ^8-12, כמו גם את תפקידו של פלח Ca פנימי ^{2 +} חנויות Ca ^{2 +} הומאוסטזיס ^13,14 . צבעי ניאון יכול לשמש גם למדידת Mg ^{2 +} בריכוז ^15, רמת החומציות, וכן קליעים נותבים של מימיות קרום התאים ^16. לבסוף, הקרינה הפנימית של כל טרנס רטינול (ויטמין A) ניתן להשתמש כדי לפקח על קינטיקה של הקמתו והסרת תאים photoreceptor יחיד ^17-19.

Protocol

1. הכנת Sylgard צלחות מלאות, לתאי ניסוי, סכיני גילוח

1. 35 מ"מ פלקון צלחות פטרי מצופות אלסטומר Sylgard יש צורך לקצוץ התקין של הרשתית מבודד להשיג תאים photoreceptor יחיד. אלסטומר מוכן על פי הוראות הספק כמות קטנה הוא שפך לתוך כל מנה כדי לכסות את תחתית שלה בשכבה. החלף צלחת מכסה לאחר ציפוי ולאחסן אותם. בעוד ימים ספורים אלסטומר מתקשה ומאכלים מוכנים.
2. Photoreceptors מבודד צורך להיצמד אל החלק התחתון של תא הניסוי, כך הם משותקים במהלך ניסוי הדמיה. זו מושגת על ידי ציפוי תחתית החדרים עם פולי-L-ליזין או פולי-L-ornithine. הוספת 200 μL של פתרון של 0.01% או אחד לכל חדר, ומכסים לתאי עם מגבת נייר כדי להגן עליהם מפני אבק. לאחר הפתרון התייבש, לשטוף עם מים לתאי חנות מזוקקים בתוך קופסה סגורה. השתמש בתוך 2 שבועות.
3. כדי לנקות את חדרי בסוף הניסוי, לשטוף אותם עם אתנול 100% כדי להסיר שמן העדשה שמן הטבילה ופסולת התא. כדי להסיר את פסולת התא, השתמש כותנה שקצהו applicators ובזהירות לשפשף את החלק התחתון של החדר. לאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים ולתת לתאי היבש לפני ציפוי מחדש.
4. גזור פיפיות סכיני גילוח לחתיכות קטנות (8 מתוך להב אחד) עם חיתוך מתכת.

2. ההכנה של פתרונות

1. הרכב של פתרונות תלוי המין. עבור דו חיים, את הצלצול של יש (ב mmol / L): 110 NaCl, KCl 2.5, 1.6 MgCl _2, 1 CaCl _2, 5 HEPES, pH = 7.55. PH צריך להיות מותאם לערך הסופי עם NaOH. עבור יונקים, את הצלצול של יש (ב mmol / L): 130 NaCl, KCl 5, 0.5 MgCl _2, 2 CaCl _2, 25-hemisodium HEPES, pH = 7.40. הפתרון של רינגר יכולים להישמר היטב אטום בטמפרטורת החדר במשך כמה חודשים.
2. גלוקוז פתרון במלאי, 1 mol / L, המשיך ב -20 ° C כדי למנוע התפתחות חיידקים.
3. ביום הניסוי, להוסיף גלוקוז לפתרון של רינגר לריכוז סופי של 5 mmol / L. בסופו של יום, למחוק את הצלצול של המכיל גלוקוז כי זה עלול לגדול חיידקים.

3. בידוד של הרשתית

1. עבור כריתה התקין של הרשתית חשוב החיה להיות כהה המותאמים לפחות 2-3 שעות לפני להקריב. בעלי חיים צריכים להיות כהה מותאם במיכל מאוורר מתאים בחדר כהה.
2. למלא שני 35 מ"מ צלחות פטרי חצי דרך עם פתרון של רינגר.
3. הקורבן חיה תחת אור אדום עמום להסיר את העיניים. בהמשך, כל ההליכים מתבצעים תחת אור אינפרא אדום באמצעות מיקרוסקופ לנתח או מצלמה עם צג וידאו.
4. הסר את כל שאריות רקמת מפני השטח החיצוני של העין. גזור להסיר את החלק הקדמי, ולאחר מכן להעביר את עיינית לאחד צלחות פטרי מלאות של רינגר.
5. הסר את הזגוגית ובזהירות להפריד את הרשתית משאר עיינית על ידי צובט את כל חיתוך או קבצים מצורפים. הרם בעדינות את הרשתית ואת זה נפרד לחלוטין מן עיינית.
6. מעבירים את הרשתית כדי בצלחת פטרי השני עם טפטפת העברת פלסטיק. שמור את המנה המכיל את הרשתית בתיבה אור חזק.

4. בידוד של תאים photoreceptor יחיד

1. כל ההליכים מתבצעים תחת אור אינפרא אדום. חותכים חתיכה קטנה של הרשתית ולהעביר אותו עם טפטפת פלסטיק צלחת Sylgard מכוסה. היקף הפתרון הכולל את פיסת הרשתית צריך להיות בערך 250 μL.
2. קחו פיסה קטנה של סכין גילוח עם בעל להב - קצה הלהב צריך להיות בזווית של כ 45 ° לבעל. שטחו את פיסת הרשתית על שכבת Sylgard באמצעות להב לקצוץ את החלק של הרשתית דק תוך שמירה על אותה שכבת דבק Sylgard.
3. העברת 200 μL של פתרון הכולל את התאים לתאי ניסיוני - לצאת כל פיסת הנותרים של הרשתית בצלחת Sylgard המכוסה. שמרו על חדר עם תאים בודדים בתיבת אור חזק.
4. חכו 10 דקות עבור התאים להתיישב, ואז להוסיף 2-3 מ"ל של רינגר. בשלב זה, התאים מבודדים ניתן לטעון עם פלורסנט לצבוע מסוים (לדוגמה Fura-2) על פי פרוטוקול הטעינה צבע.
5. התאים יכולים עתה לקחת על הבמה מיקרוסקופ לניסויים.

5. פלואורסצנטי הדמיה

1. העברה לתא לשלב של המיקרוסקופ epifluorescence. התאם פתרון זלוף, בדיקות טמפרטורה, אור אינפרא אדום, וכו '
2. סגור את הווילונות להתחיל בניסוי. כבה את האור האינפרה אדום בתוך הכלוב מיקרוסקופ, להתמקד התחתון של תא הניסוי, ולעבור את השלב מחפש תאים.

6. נציג תוצאותs:

איור. 1 מציג את המורפולוגיה של מוט מבודד בריא photoreceptors קונוס שהושגו עם פרוטוקול זה מן הרשתית סלמנדרה (Ambystoma tigrinum). תאים Salamander נעשה שימוש נרחב עבור יחיד פלואורסצנטי תא הדמיה בגלל גודל גדול ויכולתם לשרוד במשך כמה שעות לאחר במנותק מן הרשתית. בנוסף, מן הרשתית סלמנדרה אפשר להשיג באופן סדיר הן מוט photoreceptors קונוס.

אחד הקריטריונים החשובים לבריאותם של התאים הוא נוכחותם של אליפסואיד תמים (איור 1), החלק של התא שבו המיטוכונדריה מרוכזים. כאשר התאים מוצגים תחת DAPI אופטיקה, זה ריכוז של המיטוכונדריה נותן איתות הקרינה חזקה (איור 2) בשל נוכחותם של NADH. חוסר אליפסואיד שלמים היא סימן של תא פגום, פסול, בדרך כלל לצורך הניסוי. איור. 3 מראה פגום סלמנדרה מוט photoreceptor, עם גוף התא נפוחות גרעין מרוכז. תאים אלה להציג פלואורסצנציה נמוכה בהרבה מתחת DAPI אופטיקה, אבל שנצפו תחת אופטיקה FITC להראות אות FAD חזק באזור אליפסה (שמקורם נוקלאוטידים פלבין ו flavoproteins חמצון). קריטריון נוסף לבריאות photoreceptors מבודד היא יכולתם ליצור כל טרנס רטינול (ויטמין A) במגזרי החיצוני שלהם על ידי גירוי האור. הדור של ויטמין A דורשת כמויות ניכרות של NADPH, אשר תלוי מכונות מטבולית ללא פגע. איורים 4 ו -5 להראות את היווצרות ויטמין A במגזרי החיצוני של צפרדע שלם מוט photoreceptors העכבר בהתאמה.

באיור 1. בריא יחיד מוט חרוט photoreceptors. התאים היו מבודדים מן הרשתית נמר סלמנדרה. Phototransduction מתרחש במגזר החיצוני ואת אליפסה הוא ארוז בצפיפות עם המיטוכונדריה. מוטות אחראים ראייה באור עמום, חרוטים עבור החזון אור בהיר.

איור 2. Fluorescence החיים סלמנדרה מוט חרוט. אלה הם כהים המותאמים תאים, מראה NADH הקרינה חזקה ellipsoids שלהם ולא ויטמין משמעותי הקרינה במגזרי החיצוני שלהם. לכידת התמונה פלואורסצנציה מייצג החשיפה הראשונה שלהם לאור הנראה לאחר תקופה של הסתגלות כהה.

איור 3. פגומים סלמנדרה מוט photoreceptor. גוף התא נפוחות גרעין מרוכז המעידים על נזק. התא הוא מתחמצן ויש מינימלית אות NADH (DAPI אופטיקה), אלא אות FAD הרבה יותר חזק (FITC אופטיקה).

איור 4. צפרדע עם מוט NADH ו רטינול. זהו צפרדע בריא מוט photoreceptor מראה NADH הקרינה חזקה באזור אליפסה. לפני חשיפה לאור יש פלואורסצנציה מינימלי בקטע החיצוני. בעקבות חשיפה לאור, ישנו גידול משמעותי הקרינה את הקטע החיצוני עקב היווצרות של ויטמין A.

איור 5. עכבר מוט עם רטינול. זהו עכבר בריא מוט photoreceptor מראה פלח משמעותי הקרינה החיצוני לאחר חשיפה לאור עקב היווצרות של ויטמין A. האזורים אליפטיים של photoreceptors מוט העכבר לא מראים אות הקרינה חזקה.

Discussion

אם מבודדים תאים בריאים לא מתקבלים, הבעיה נעוצה גם עם בידוד או לבריאות של הרשתית או עם הקיצוץ שלה. בדרך כלל, לאחר הסרת הקדמי של העין ואת הזגוגית, הרשתית בקלות מרים את אפיתל הפיגמנט. אם לא, לנסות לקלף אותו החל בפריפריה של עיינית. אם זה עדיין קשה להפריד, אפשרות סבירה היא כי בעל החיים לא היה כהה מותאם לתקופה בלתי הולמת של זמן, או אור אדום בהיר מדי. ודא הסתגלות כהה מתאים החיה, ואור עמום האדום. הנוכחות של קולטני האור ברשתית מוט ניתן לקביעה בקלות על ידי סימון צבע של הרשתית מבודדים: לחתוך חתיכה קטנה של הרשתית ולהעביר אותו בצלחת פטרי נפרדות, אשר לאחר מכן ניתן לראות תחת אורות החדר. חתיכת מוט קולטני האור ברשתית ובו יש צבע אדום בהיר (עקב rhodopsin) כי נמוג במהירות. חתיכת חסר צבע היה להצביע על העדר rhodopsin, ומכאן של photoreceptors מוט. זה יכול להיות אם בשל ההפרדה לא תקין של הרשתית מן אפיתל הפיגמנט ברשתית או לא בריא. במקרה כזה, אתה צריך להבטיח את בריאות בעלי החיים והסתגלות כהה הנכון. אם הרשתית בריא מתקבל אך בתאים מבודדים לא בריא, אז הבעיה היא ככל הנראה עם החיתוך. קיצוץ בסדר היא קריטית: אם הקיצוץ הוא גס מדי, או הרשתית הופך לקלף, התוצאה היא בעיקר יצירות של הרשתית במקום תאים מבודדים. קיצוץ טוב בדרך כלל התוצאות "ענן" של תאים המופיעים הפתרון.

דימות פלואורסצנטי של תאים photoreceptors אחד יכול להשתמש fluorophores תא אנדוגניים כגון NADH, FAD או ויטמין A, כמו גם צבעי ניאון רגיש לגורמים שונים, כדי לבחון מגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים בזמן אמת. השיטה ניתן להחיל על מינים שונים, כולל דו חיים כמו סלמנדרה (Ambystoma tigrinum) ^17,18 ו צפרדע (Rana pipiens) ^20, לטאות (Gecko השממית) ^21, דגים (דג הזברה, Danio rerio) ^11, ועכבר (Mus שריר) ^22. הרחבה של השיטה לתאי העכבר מאפשר לימוד של סוגים שונים של בעלי חיים מהונדסים גנטית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dark room (100-150 ft2)
Red lights19			Online stores
Infrared light sources andinfrared image viewers	FJW Optical Systems, Inc.
Dissecting microscope19			Outfitted with infrared viewers
Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19
Dissecting tools(scissors, forceps, blade holder)	Roboz Surgical Instruments Co.
Sylgard elastomer	Essex (Charlotte, NC)	Sylgard 184 elastomer kit
Poly-L-ornithine (0.01%)	Sigma-Aldrich	P4957
Poly-L-lysine (0.1%)	Sigma-Aldrich	P8920	Dilute to 0.01%
Experimental chambers	Warner Instruments	D3512P
Petri dishes, plastic pipettes	Fisher Scientific