Summary
Floresan görüntüleme için farklı omurgalı türlerin tek yaşam fotoreseptör hücrelerinin hazırlanması için bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem, NADH ya da A vitamini gibi endojen fluorophores, floresan görüntü veya Ca duyarlı Eksojen olarak eklenmiş floresan boyalar olabilir
Abstract
Gözdeki, phototransduction ışık, bir elektrik sinyali dönüşüm, çubuk ve koni fotoreseptör hücrelerinin 1-4 tarafından yürütülmektedir. Rod fotoreseptörlerin loş ışıkta görme, parlak ışık konileri sorumludur. Phototransduction fotoreseptör hücre, görsel pigment, birincil ışık detektörü yüksek konsantrasyonda içeren özel bir bölmesi dış segmentinde yer alır. Retina cis, protein, opsin bağlı bir kromofor, 11 görme pigmenti oluşur. Görsel pigment tarafından emilir bir foton 11 kromofor isomerizes - cis-trans. Bu photoisomerization membran potansiyeli bir değişiklik sonuçlanan ve bir elektrik sinyali ışık uyaran transdüksiyon hakkında getirerek reaksiyonlar zincirini başlatan görsel pigment konformasyonel değişikliği beraberinde getiriyor. Işık uyarımı hücre kurtarma ışık ile aktive ara devre dışı bırakma ve membran potansiyeli yeniden kurulması içerir. Ca 2 + birkaç phototransduction yer alan enzimlerin aktivitesini modüle ve konsantrasyonu ışık uyarımı üzerine azalır. Bu şekilde, Ca 2 + hücre arka plan ışığı, ışık uyarılması ve adaptasyonu kurtarma önemli bir rol oynar .
All-trans 5-7 cis kromofor iyileşme sürecinin bir diğer önemli bölümü, 11 photoisomerization ışık algılama sırasında tahrip olmuştur görsel pigment rejenerasyon. Bu yenilenme, apo-protein opsin geride bırakarak, all-trans retina photoactivated pigmenti tarafından serbest bırakılması ile başlar . Serbest bırakılan all-trans retina all-trans retinol, ve opsin NADPH kullanan bir tepki olarak hızla azalır, taze 11 ile birleşir - cis retina, görme pigmenti reform dış segmente getirilen. All-trans retinol sonra uzman taşıyıcı Interphotoreceptor retinoid Bağlayıcı Protein (IRBP) dış segmente ve komşu hücre içine transfer edilir.
Floresan görüntüleme tek fotoreseptör hücrelerinin fizyolojisi ve hücre biyolojisi okumak için kullanılabilir. Ca 2 + duyarlı floresan boyalar 8-12 iç segmenti Ca 2 Ca 2 + mağazalar rolünün yanı sıra ışık dış segmente Ca 2 + değişiklikleri ve tepki arasındaki etkileşimi ayrıntılı olarak incelemek için kullanılabilir + homeostazı 13,14 . Floresan boyalar Mg 2 ölçmek için kullanılabilir + konsantrasyonu 15, pH, sulu ve membran bölmeleri 16 izleyiciler olarak. Son olarak, tüm-trans retinol (A vitamini) içsel floresan 17-19 tek fotoreseptör hücrelerinin oluşumu ve kaldırma kinetiği izlemek için kullanılabilir.
Protocol
1. Sylgard kapaklı sahanlar, deneysel odaları ve tıraş bıçakları hazırlanması
- Sylgard elastomer ile kaplı 35 mm Falcon Petri kutularına tek fotoreseptör hücreleri elde etmek için izole bir retina uygun kesme için gerekli. Elastomer tedarikçinin talimatlarına ve küçük bir miktar, bir tabaka ile alt kapak her çanak dökülür göre hazırlanır. Çanak kaplama sonra kapsar değiştirin ve saklayın. Elastomer birkaç gün zaman sertleşir ve bulaşıkları hazırız.
- Böylece onlar bir görüntüleme deney sırasında hareketsiz İzole fotoreseptörlerin deneysel odasının alt sopa gerekir. Bu poli-L-lizin veya poli-L-ornitin odaları dipleri kaplama ile elde edilir. % 0.01 çözüm odasının her biri 200 mcL ekleyin ve tozdan korumak için bir kağıt havlu ile odaları kapsamaz. Çözüm kuruduktan sonra odaları, kapalı bir kutu distile su ve mağaza ile yıkayın. 2 hafta içinde kullanın.
- Bir denemenin sonunda odaları temizlemek için herhangi bir yağ, yağ immersiyon objektif ve hücre enkaz kaldırmak için% 100 etanol ile yıkayın. Hücre enkaz kaldırmak için, pamuk uçlu aplikatörler kullanın ve odanın alt dikkatlice fırçalayın. Daha sonra, saf su ile yıkayın ve yeniden kaplama önce odaları kurumaya bırakın.
- Metal kesici ile küçük parçalar (8 bir bıçak) çift kenarlı Jilet kesin.
2. Çözeltilerin hazırlanması
- Çözümlerinin bileşimi türüne bağlıdır. Amfibiler için, Ringer (mmol / L): 110 NaCl, 2.5 KCl, 1.6 MgCl 2, 1 CaCl 2, 5 Hepes, pH = 7.55. PH NaOH ile nihai değere ayarlanması gerekir. Memeliler için, Ringer (mmol / L): 130 NaCl, KCl 5, 0.5 MgCl 2, 2 CaCl 2, 25 hemisodium-HEPES, pH = 7.40. Ringer çözüm birkaç ay için, oda sıcaklığında iyi mühürlü muhafaza edilebilir.
- Bakteri büyümesini önlemek için -20 ° C'de muhafaza Stok glukoz çözeltisi, 1 mol / L.
- Deney günü, son 5 mmol / L konsantrasyonu Ringer çözümü için glikoz Günün sonunda, Ringer bakterilerin üremesine çünkü glikoz içeren atın.
3. Retina, izolasyon
- Retinanın uygun eksizyon için hayvan kurban önce en az 2-3 saat karanlık adapte olması önemlidir. Hayvanlar karanlık oda havalandırılmış uygun bir kapta koyu adapte edilmelidir.
- Yarı yolda Ringer solüsyonu ile iki adet 35 mm Petri kapları doldurun.
- Loş kırmızı ışık altında hayvan kurban ve gözleri kaldırın. Daha sonra, tüm işlemleri bir diseksiyon mikroskobu veya bir video monitör ile birlikte bir kamera kullanarak kızılötesi ışığı altında yürütülmektedir.
- Gözün dış yüzeyinde herhangi bir artık doku çıkarın. Kes ve ön bölümü kaldırmak, daha sonra Ringer dolu Petri kutularına biri haline Göz yuvası aktarın.
- Vitreus çıkarın ve dikkatli bir kısma ya da herhangi bir ek kesme Göz yuvası geri kalanı retinanın ayrılması. Retinanın hafifçe kaldırın ve Vizör adaptör tamamen ayrı.
- Ikinci Petri kabı, plastik bir transfer pipet yardımıyla retina aktarın. Retinanın bir ışık geçirmez kutu içeren çanak tutun.
4. Tek fotoreseptör hücrelerinin izolasyonu
- Tüm işlemler kızılötesi ışık altında yürütülmektedir. Retinanın küçük bir parça kesin ve Sylgard kaplı çanak plastik bir pipet ile transfer. Retina parça içeren solüsyon hacmi 250 mcL ilgili olmalıdır.
- Jilet bıçak tutucu ile küçük bir parça Grab bıçak kenarına sahibine yaklaşık 45 ° açı olmalıdır. Sylgard tabakası retina parça düzleştirin ve Sylgard katmanı yapışmış tutarak bıçağı ince retina parça doğrayın.
- Çözümün bir deney odasına hücreleri içeren 200 mcL Transferi - retinanın Sylgard kaplı bir tabak içinde kalan herhangi bir parçası bırakın. Odanın ışık geçirmez bir kutuya izole hücreleri ile tutun.
- 2-3 ml Ringer eklemek, sonra yerleşmek için hücreler için 10 dakika bekleyin. Bu aşamada, boya yükleme protokole göre izole hücrelerin belirli bir floresan boya (örneğin Fura-2) ile yüklü olabilir.
- Hücreler artık deneyler için mikroskop aşamasında alınabilir.
5. Floresans görüntüleme
- Odanın Epifloresans mikroskop sahneye aktarın. Ayarlayın çözüm perfüzyon, sıcaklık probları, kızılötesi aydınlatma, vs.
- Perdeleri kapatın ve deneme başlayacaktır. Mikroskop kafes içinde kızılötesi ışık açın, deneysel odasının alt odaklanmak ve hücreler için sahne taşımak.
6. Temsilcisi Sonucus:
Şekil 1. Bu protokol ile elde edilen bir semender (Ambystoma tigrinum) retinanın sağlıklı izole çubuk ve koni fotoreseptörlerin morfolojisi gösterir. Salamander hücreleri nedeniyle büyük boyutta ve birkaç saat sonra retina izolasyonu hayatta kalmak için yeteneklerini tek bir hücre floresan görüntüleme çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. Buna ek olarak, bir semender retinanın bir çubuk ve koni fotoreseptörlerin hem de düzenli olarak elde edebilirsiniz.
Hücrelerinin sağlığı için önemli bir kriter, sağlam bir elipsoid (Şekil 1), mitokondri yoğunlaşmıştır hücrenin bir parçası varlığıdır . Mitokondri hücreleri DAPI optik altında incelendi, bu konsantrasyon NADH varlığı nedeniyle, güçlü bir floresan sinyal (Şekil 2) verir . Sağlam bir elipsoid hasarlı hücre eksikliği genellikle deney Şekil için uygun olmayan bir işareti. 3 şişmiş bir hücre gövdesi ve yoğunlaştırılmış bir çekirdeği, bozuk bir semender çubuk fotoreseptör gösterir. Bu tür hücreler DAPI optik altında çok düşük floresan ekran, ama elipsoid bölge (okside flavin nükleotidler ve flavoproteins kaynaklanan) güçlü bir FAD sinyal göstermiyor FITC optik altında incelendi. Izole fotoreseptörlerin sağlık için bir başka kriter ışıkta stimülasyon üzerine dış segmentlerinde tüm-trans retinol (A vitamini) oluşturmak için yeteneğidir. A vitamini nesil önemli miktarda sağlam bir metabolik makine bağlıdır NADPH gerektirir. Şekil 4 ve 5 vitamini sağlam kurbağa ve fare çubuk fotoreseptör sırasıyla dış segmentlerinde bir oluşum göstermektedir.
Şekil 1. Sağlıklı bir tek çubuk ve koni fotoreseptör hücrelerinin, bir kaplan semender retina izole edildi. Phototransduction dış segmentinde yer alır ve elipsoid yoğun mitokondri ile doludur. Çubuklar loş ışıkta görme, parlak ışık görüş için koniler için sorumludur.
Şekil 2. Semender çubuk ve koni yaşam Floresan Bu kendi elipsoitlerin güçlü NADH floresan ve dış segmentlerinde anlamlı vitamin A floresan gösteren, koyu adapte hücrelerdir. Floresan görüntü yakalama, görünür ışık karanlık adaptasyon döneminden sonra ilk poz temsil eder.
Şekil 3. Hasarlı semender çubuk fotoreseptör. Şişmiş hücre gövdesi ve özet çekirdeği hasar göstergesidir. Hücre ve okside minimal NADH sinyali (DAPI optik) var, ama çok daha güçlü FAD sinyali (FITC optik).
Şekil 4. NADH ve retinol ile Kurbağa çubuk elipsoid bölgede güçlü NADH floresan gösteren sağlıklı bir kurbağa çubuk fotoreseptör. Önce dış segmente minimal floresan ışığa maruz kalma var. Işığa maruz kalma ardından, A vitamini oluşumu nedeniyle, dış segmentinde floresan önemli bir artış var.
Şekil 5. Retinol ile Fare çubuk Bu sağlıklı bir fare fare çubuk fotoreseptörlerin elipsoid bölgelerinde güçlü bir floresan sinyal görünmüyor A vitamini oluşumu nedeniyle ışık maruz kaldıktan sonra önemli dış segmente floresan gösteren çubuk fotoreseptör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Izole sağlıklı hücreler elde değilseniz, retinanın izolasyonu veya sağlık sorunu ya da doğrama ya yatıyor. Tipik olarak, göz ve vitreus ön çıkardıktan sonra, retina pigment epitel kolayca havalandığı. Göz yuvası çevreden başlayarak kapalı değilse, bunu kabuğu deneyin. Hala ayırmak için zor ise, daha büyük bir olasılık hayvan yeterli bir zaman dilimi için koyu adapte olmamıştır, ya da kırmızı ışık çok parlak. Hayvan için uygun karanlık adaptasyonu, ve loş kırmızı ışık olun. Retinada çubuk fotoreseptörlerin varlığı izole retina rengini kontrol ederek kolayca tespit edilebilir: retinanın küçük bir parça kesme ve daha sonra oda ışıkları altında görülebilir ayrı bir Petri kabı, transfer. Retinanın içeren çubuk fotoreseptör bir parçası hızla parlak kırmızı renk (rodopsin nedeniyle) kaybolur. Renksiz bir parça rodopsin yokluğunda gösterirler ve bu nedenle çubuk fotoreseptör. Bu, ya yanlış ayırma retina pigment epitel ya da sağlıksız bir retinaya bağlı olabilir. Böyle bir durumda, hayvanları ve bunların uygun karanlık adaptasyonu sağlığını güvence altına almalıdır. Sağlıklı bir retina elde edilen fakat izole hücrelerin sağlıklı değil, o zaman sorun doğrama ile büyük olasılıkla. Kritik bir ince doğrama doğrama çok kaba olup olmadığını, ya da retina yanılmak olur, çoğunlukla izole hücrelerinin yerine retinanın adet sonuçlanır. İyi kesim genellikle çözüm görünen hücrelerin bir "bulut" sonuçlanır.
Tek fotoreseptör hücrelerinin floresan görüntüleme gerçek zamanlı olarak fizyolojik süreçleri geniş bir prob, NADH, FAD ya da A vitamini gibi endojen hücre fluorophores yanı sıra farklı faktörlere duyarlı floresan boyaları kullanabilirsiniz. Bu yöntem, semender (Ambystoma tigrinum) 17,18 ve kurbağası (Rana pipiens) 20 amfibiyenler gibi, kertenkele (Gecko gecko) 21, balık (zebrafish Danio rerio) 11 ve faresi (Mus da dahil olmak üzere pek çok farklı türler, uygulanabilir musculus) 22. Uzatma yöntemi fare hücreleri genetik olarak değiştirilmiş hayvanların farklı türde çalışma sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
NEI hibe EY014850 tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources andinfrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools(scissors, forceps, blade holder) | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
- Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction. Neuron. 48, 387-401 (2005).
- Ebrey, T., Koutalos, Y.
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y.
- Palczewski, K.
- Saari, J. C. Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).
- Lamb, T. D., Pugh, E. N. Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision. Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).
- Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision. Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods. J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors. J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).
- Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice. J Physiol. 542, 843-854 (2002).
- Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish. J Physiol. 579, 15-27 (2007).
- Matthews, H. R., Fain, G. L. Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors. Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).
- Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors. J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).
- Krizaj, D., Copenhagen, D. R. Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors. Neuron. 21, 249-256 (1998).
- Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments. J Physiol. 553, 125-135 (2003).
- Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks. Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).
- Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors. J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).
- Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology. J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).
- Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors. Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).
- Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments. Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).
- Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors. Vision Res. 47, 363-374 (2007).
- Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).
