Summary
प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए विभिन्न हड्डीवाला प्रजातियों में से एक में रहने वाले फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की तैयारी के लिए एक विधि वर्णित है. विधि NADH या विटामिन ए के रूप में अंतर्जात fluorophores, प्रतिदीप्ति छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या कि exogenously जोडी फ्लोरोसेंट Ca के लिए संवेदनशील रंगों की
Protocol
1. Sylgard कवर बर्तन, प्रयोगात्मक कक्षों, और रेज़र ब्लेड की तैयारी
- 35 मिमी फाल्कन पेट्री Sylgard elastomer के साथ लेपित व्यंजन एकल फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए एक अलग रेटिना के उचित काट के लिए की जरूरत है. elastomer आपूर्तिकर्ता के निर्देशों और एक छोटी राशि प्रत्येक डिश में डाल दिया है एक परत के साथ नीचे कवर करने के लिए अनुसार तैयार की है. बदलें पकवान कोटिंग के बाद शामिल हैं और उन्हें दुकान. कुछ दिनों के समय में इलास्टोमेर hardens और व्यंजन तैयार कर रहे हैं.
- पृथक photoreceptors प्रयोगात्मक चैम्बर के नीचे करने के लिए छड़ी की जरूरत है ताकि वे एक इमेजिंग प्रयोग के दौरान immobilized कर रहे हैं. इस कोटिंग के द्वारा हासिल की है पाली एल lysine या पाली एल ओर्निथिन के साथ कक्षों के नीचे है. चैम्बर प्रति या तो एक के 0.01% के समाधान के 200 μL जोड़ें, और एक कागज तौलिया के साथ कक्षों को कवर करने के लिए उन्हें धूल से बचाने के. समाधान के बाद सूख गया है, और एक बंद बॉक्स में आसुत पानी की दुकान के साथ कक्षों धोने. 2 हफ्तों के भीतर का उपयोग करें.
- कक्षों के लिए एक प्रयोग के अंत में साफ करने के लिए, 100% इथेनॉल के साथ उन्हें धोने के लिए तेल विसर्जन लेंस और सेल मलबे से किसी भी तेल निकाल दें. सेल मलबे को हटाने के लिये, कपास इत्तला दे दी applicators का उपयोग करें और ध्यान कक्ष के नीचे रगडें. बाद में, आसुत जल के साथ धोने और कक्षों फिर कोटिंग से पहले सूखा चलो.
- एक धातु कटर (8 एक ब्लेड से) के साथ छोटे टुकड़ों में कट दोधारी रेज़र ब्लेड.
2. समाधान की तैयारी
- समाधान की रचना प्रजातियों पर निर्भर करता है. उभयचर के लिए, घंटी (mmol / एल में): 110 NaCl, 2.5 KCl, 1.6 2 MgCl, 1 2 CaCl, 5 HEPES, 7.55 = पीएच. पीएच NaOH के साथ अंतिम मूल्य के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. स्तनधारियों के लिए, घंटी (mmol / एल में): 130 NaCl, 5 KCl, 0.5 MgCl 2, 2 2 CaCl, 25 hemisodium - HEPES = 7.40 पीएच. घंटी समाधान कुछ महीनों के लिए कमरे के तापमान पर अच्छी तरह से सील रखा जा सकता है.
- शेयर ग्लूकोज समाधान, 1 mol / एल -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा बैक्टीरियल वृद्धि से बचने के.
- प्रयोग के दिन, घंटी समाधान के लिए ग्लूकोज 5 mmol / एल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ दिन के अंत में, घंटी है कि ग्लूकोज शामिल हैं क्योंकि यह बैक्टीरिया बढ़ने सकता है त्यागें.
3. Retinas के अलगाव
- रेटिना के उचित छांटना के लिए यह महत्वपूर्ण है कि जानवर बलिदान से पहले कम से कम 2-3 घंटे के लिए अंधेरे अनुकूलित किया जा. पशु काले अंधेरे कमरे में एक उपयुक्त हवादार कंटेनर में अनुकूलित किया जाना चाहिए.
- घंटी समाधान के साथ आधे मार्ग में दो 35 मिमी पेट्री डिश भरें.
- मंद लाल बत्ती के तहत जानवर बलिदान और आंखों को हटा दें. बाद में, सभी प्रक्रियाओं बाहर अवरक्त प्रकाश के तहत एक विदारक माइक्रोस्कोप या एक वीडियो मॉनीटर के साथ एक कैमरा का उपयोग किया जाता है.
- आँख के बाहर की सतह से बचे हुए किसी भी ऊतक निकालें. काटें और पूर्वकाल हिस्सा निकाल, तो एक घंटी है के साथ भरा पेट्री व्यंजन में eyecup हस्तांतरण.
- शीशे निकालें और ध्यान से eyecup के बाकी हिस्सों से बंद बन्द रखो या किसी भी संलग्नक को काटने के द्वारा रेटिना अलग. धीरे रेटिना उठा और यह eyecup से पूरी तरह अलग है.
- दूसरी पेट्री डिश के लिए एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के साथ रेटिना स्थानांतरण. प्रकाश तंग एक बॉक्स में रेटिना युक्त डिश रखें.
4. एकल फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के अलगाव
- सभी प्रक्रियाओं बाहर अवरक्त प्रकाश के तहत किया जाता है. रेटिना का एक छोटा सा टुकड़ा काट और एक प्लास्टिक विंदुक के साथ यह Sylgard कवर एक डिश के लिए स्थानांतरण. रेटिना टुकड़ा युक्त समाधान की मात्रा 250 μL के बारे में होना चाहिए.
- ब्लेड धारक के साथ एक धार का छोटा सा टुकड़ा ले लो - ब्लेड के किनारे लगभग 45 ° धारक के कोण पर किया जाना चाहिए. Sylgard परत पर रेटिना के टुकड़े समतल और ब्लेड रेटिना के पतले टुकड़े काट जबकि रखते हुए यह Sylgard परत करने के लिए अटक का उपयोग.
- एक प्रयोगात्मक कक्ष कोशिकाओं से युक्त समाधान के 200 μL स्थानांतरण - Sylgard कवर पकवान में रेटिना के किसी भी शेष टुकड़ा छोड़. प्रकाश तंग एक बॉक्स में अलग कक्षों के साथ चैम्बर रखें.
- व्यवस्थित कोशिकाओं के लिए 10 मिनट के लिए रुको, तो घंटी है 2-3 एमएल जोड़ने. इस स्तर पर, अलग कक्षों डाई लोड हो रहा है प्रोटोकॉल के अनुसार एक विशेष फ्लोरोसेंट डाई Fura-2 उदाहरण के लिए () के साथ लोड किया जा सकता है.
- कोशिकाओं को अब प्रयोगों के लिए माइक्रोस्कोप चरण के लिए लिया जा सकता है.
5. प्रतिदीप्ति इमेजिंग
- चैम्बर epifluorescence खुर्दबीन के मंच पर स्थानांतरण. समायोजित समाधान छिड़काव, तापमान जांच, अवरक्त रोशनी, आदि
- पर्दे बंद करो और प्रयोग शुरू. खुर्दबीन पिंजरे के अंदर अवरक्त प्रकाश पर मुड़ें, प्रायोगिक कक्ष के नीचे पर ध्यान केंद्रित है, और कोशिकाओं के लिए देख चरण ले जाने के.
6. प्रतिनिधि नतीजेs:
चित्र 1 स्वस्थ पृथक रॉड और कोन photoreceptors इस प्रोटोकॉल के साथ एक समन्दर रेटिना (Ambystoma tigrinum) से प्राप्त की आकारिकी से पता चलता है. समन्दर कोशिकाओं एकल कक्ष प्रतिदीप्ति इमेजिंग अध्ययन के लिए उनके बड़े आकार और उनके रेटिना से अलगाव के बाद कई घंटे के लिए जीवित रहने की क्षमता की वजह से किया गया है बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया. इसके अलावा, एक समन्दर रेटिना से एक नियमित रूप से दोनों रॉड और कोन photoreceptors प्राप्त कर सकते हैं.
कोशिकाओं के स्वास्थ्य के लिए एक महत्वपूर्ण मानदंड की उपस्थिति एक अक्षुण्ण दीर्घवृत्ताभ (1 छवि), सेल जहां mitochondria केंद्रित कर रहे हैं का हिस्सा है. जब कोशिकाओं DAPI प्रकाशिकी के तहत देखा जाता है, mitochondria की इस एकाग्रता एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत (छवि 2) NADH की उपस्थिति के कारण देता है . एक अक्षुण्ण दीर्घवृत्ताभ की कमी एक क्षतिग्रस्त कोशिका का एक संकेत है, आम तौर पर प्रयोग. अंजीर के लिए अयोग्य है. 3 एक क्षतिग्रस्त समन्दर रॉड फोटोरिसेप्टर एक सूजन सेल शरीर और एक संक्षिप्त नाभिक के साथ दिखाता है . ऐसी कोशिकाओं DAPI प्रकाशिकी के तहत बहुत कम प्रतिदीप्ति प्रदर्शन, लेकिन FITC प्रकाशिकी नीचे देखा दीर्घवृत्ताभ क्षेत्र (ऑक्सीकरण पीला रंग nucleotides और flavoproteins से प्रारंभिक) में एक मजबूत धुनी संकेत दिखा. पृथक photoreceptors के स्वास्थ्य के लिए एक और कसौटी उनके उत्तेजना पर उनके बाहरी क्षेत्रों में प्रकाश द्वारा सभी ट्रांस रेटिनोल (विटामिन ए) उत्पन्न करने की क्षमता है. विटामिन ए की पीढ़ी NADPH, जो एक अक्षुण्ण चयापचय मशीनरी पर निर्भर करता है की पर्याप्त मात्रा की आवश्यकता है. 4 और 5 आंकड़े बरकरार मेंढक और माउस रॉड photoreceptors क्रमशः के बाहरी क्षेत्रों में विटामिन ए के गठन दिखा.
चित्रा 1. स्वस्थ एकल रॉड और कोन photoreceptors कोशिकाओं एक बाघ समन्दर रेटिना से अलग थे. Phototransduction बाहरी खंड में जगह लेता है और दीर्घवृत्ताभ घनी mitochondria के साथ पैक है. छड़ मंद प्रकाश दृष्टि, उज्ज्वल प्रकाश दृष्टि के लिए शंकु के लिए जिम्मेदार हैं.
चित्रा 2. समन्दर रॉड और कोन रहने के प्रतिदीप्ति. ये काले रूपांतरित कोशिकाओं रहे हैं, उनके संबंधित ellipsoids में मजबूत NADH प्रतिदीप्ति और कोई महत्वपूर्ण विटामिन अपने बाहरी क्षेत्रों में एक प्रतिदीप्ति दिखा. प्रतिदीप्ति छवि का कब्जा काले अनुकूलन की अवधि के बाद अपने दृश्य प्रकाश के लिए पहला प्रदर्शन का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 3. क्षतिग्रस्त समन्दर रॉड फोटोरिसेप्टर सूजन सेल शरीर और गाढ़ा नाभिक नुकसान का संकेत कर रहे हैं. सेल ऑक्सीकरण है और वहाँ न्यूनतम NADH संकेत (DAPI प्रकाशिकी) है, लेकिन बहुत मजबूत धुनी संकेत (FITC प्रकाशिकी).
चित्रा 4. NADH और retinol के साथ मेंढक छड़ी. यह एक स्वस्थ मेंढक छड़ी दीर्घवृत्ताभ क्षेत्र में मजबूत NADH प्रतिदीप्ति दिखा फोटोरिसेप्टर है. प्रकाश जोखिम से पहले बाहरी खंड में कम से कम प्रतिदीप्ति है. प्रकाश जोखिम के बाद, वहाँ बाहरी खंड प्रतिदीप्ति में विटामिन ए के गठन की वजह से एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई है
चित्रा 5. Retinol के साथ माउस रॉड. यह एक स्वस्थ माउस छड़ी प्रकाश विटामिन ए के गठन माउस रॉड photoreceptors के दीर्घवृत्ताभ क्षेत्रों में एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत नहीं दिखा कारण प्रदर्शन के बाद महत्वपूर्ण बाहरी खंड प्रतिदीप्ति दिखा फोटोरिसेप्टर है .
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Discussion
यदि स्वस्थ अलग कक्षों को नहीं प्राप्त कर रहे हैं, समस्या या तो अलगाव या रेटिना के स्वास्थ्य के साथ या उसके काट के साथ निहित है. आमतौर पर, आंख और शीशे के सामने हटाने के बाद, रेटिना आसानी से बंद वर्णक उपकला लिफ्टों. यदि ऐसा नहीं होता, eyecup की परिधि से शुरू बंद इसे छील करने के लिए प्रयास करें. यदि यह अभी भी मुश्किल अलग है, एक संभावना संभावना है कि जानवर अंधेरे समय की एक पर्याप्त अवधि के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है, या लाल बत्ती भी उज्ज्वल है. पशुओं के लिए उचित अनुकूलन अंधेरे, और मंद लाल बत्ती सुनिश्चित करें. रेटिना में रॉड photoreceptors के उपस्थिति पृथक रेटिना का रंग की जाँच के द्वारा आसानी से पता लगाया जा सकता है: रेटिना का एक छोटा सा टुकड़ा काट और यह एक अलग पेट्री डिश है, जो तब कमरे रोशनी के तहत देखा जा सकता है है हस्तांतरण. छड़ी युक्त रेटिना photoreceptors के एक टुकड़ा एक चमकदार लाल रंग (कारण rhodopsin) है कि fades तेजी है. एक रंगहीन टुकड़ा rhodopsin की अनुपस्थिति का संकेत है, और इसलिए रॉड photoreceptors के. यह या तो वर्णक उपकला से रेटिना के अनुचित जुदाई या एक अस्वास्थ्यकर रेटिना के लिए कारण हो सकता है. ऐसे मामले में, आप यह सुनिश्चित करना चाहिए जानवरों के स्वास्थ्य और उनके उचित अंधेरे अनुकूलन. यदि एक स्वस्थ रेटिना प्राप्त है लेकिन स्वस्थ नहीं पृथक कोशिकाओं, तो समस्या काट के साथ सबसे अधिक संभावना है. ठीक काट महत्वपूर्ण है: यदि काट बहुत मोटे है, या रेटिना unstuck हो जाता है, यह अलग कक्षों के बजाय रेटिना के टुकड़े में ज्यादातर परिणाम है. अच्छा काट आम तौर पर समाधान में प्रदर्शित होने की कोशिकाओं के एक "बादल" में परिणाम है.
एकल photoreceptors कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति इमेजिंग NADH, धुनी या विटामिन ए के रूप में अंतर्जात सेल fluorophores, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विभिन्न कारकों के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक उपयोग करते हैं, वास्तविक समय में एक शारीरिक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत रेंज की जांच कर सकते हैं. विधि (Ambystoma tigrinum) समन्दर 17,18 और मेंढक (राणा pipiens) 20 जैसे उभयचर, छिपकली (छिपकली छिपकली) 21, मछली (zebrafish, Danio rerio) 11, और माउस (Mus सहित कई अलग अलग प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है मस्कुलस) 22. माउस कोशिकाओं के लिए विधि का विस्तार आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों के विभिन्न प्रकार के अध्ययन की अनुमति देता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
Nei अनुदान EY014850 द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources andinfrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools(scissors, forceps, blade holder) | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
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