Summary
方法は、蛍光イメージングのための別の脊椎動物種から単生きた光受容細胞の調製のために説明されています。方法は、画像にそのようなNADHやビタミンAなどの内因性蛍光体の蛍光を使用し、又はCaに敏感な外因的に添加蛍光色素のことができる
Abstract
脊椎動物の網膜では、光伝達、電気信号に光の変換は、桿体と錐体視細胞1〜4で行われている。桿体は薄暗い光のビジョン、明るい光の円錐形のための責任があります。光伝達は光受容細胞、視色素、一次光検出器の高濃度が含まれている特殊なコンパートメントの外側の部分で行われます。視覚的な色素は、発色団、11で構成されて-タンパク質、オプシンに添付された、 シスレチナール。すべてのトランスへのシス -視覚色素によって吸収された光子は、11から発色団を異性化。この光異性化は、膜電位の変化で絶頂に達すると電気信号に光刺激の伝達をもたらす反応のカスケードを開始する視覚色素のコンフォメーション変化をもたらす。光刺激から細胞の回復は、光によって活性化中間体の不活性化、および膜電位の再確立を行います。のCa 2 +は、光情報伝達に関与する酵素のいくつかの活性を変調し、その濃度は、光刺激により低減されます。この方法では、Ca 2 +は背景光の光刺激とその適応からの細胞の回復において重要な役割を果たしている。
全トランス 5月7日にシス発色団-回復のプロセスの別の本質的な部分はその11の光異性化による光検出の際に破棄されている視覚色素の再生です。この再生は、アポタンパク質のオプシンを残し、光活性化顔料によって全トランスレチナールのリリースから始まります。リリースされたすべてのトランスレチナールは急速に全- トランスレチノールにNADPHを利用する反応で減少し、オプシンは新鮮な11で結合している-視覚的な色素を改革するために外側のセグメントに持ち込まれた網膜シス 。全- トランスレチノールは、専門のキャリアInterphotoreceptorレチノイド結合タンパク質（IRBP）で外側のセグメントで構成し、隣接する細胞へ搬出される。
単一視細胞の蛍光イメージングは、それらの生理学および細胞生物学を研究するために使用することができます。 のCa 2 +感受性蛍光色素8月12日だけでなく、内側のセグメントのCa 2の役割のCa 2 +ストアを明るみに詳細に外側のセグメントのCa 2 +の変化と応答の間の相互作用を調べるために使用することができます+ホメオスタシス13,14 。蛍光染料はまたのMg 2を測定するために使用することができます+濃度15、pHを、水性および膜のコンパートメント16のトレーサーとして。最後に、全- トランスレチノール（ビタミンA）の固有蛍光が単一の視細胞17から19で、その形成と除去の速度を監視するために使用することができます。
Protocol
1。 Sylgardに覆われた皿、実験チャンバー、そり及びその刃の準備
- Sylgardのエラストマーでコーティングさ35ミリメートルファルコンペトリ皿は、単一の視細胞を得るために単離網膜の適切なチョッピングのために必要とされる。エラストマーは、供給者の指示と少量の層で、その底部をカバーするためにそれぞれの皿に注がれるにしたがって調製される。皿はコーティング後にカバーを取り付け、それらを保存する。数日後にはエラストマーが硬化すると料理が準備が整いました。
- 彼らはイメージング実験の過程で固定化されるように孤立した光受容体は、実験室の底に固執する必要があります。これは、ポリ- L -リジンまたはポリ- L -オルニチンでコーティングすることによりチャンバーの底を実現しています。室ごとにいずれかの0.01％溶液200μLを追加し、ほこりからそれらを保護するためにペーパータオルでチャンバーを覆う。解決策が乾燥した後、密閉ボックス内の蒸留水とストアを持つチャンバーを洗浄する。 2週間以内でご使用ください。
- 実験終了時に室をクリーニングするには、油浸レンズと細胞の破片から任意の油を除去するために100％エタノールでそれらを洗ってください。細胞破片を除去するために、綿棒のアプリケーターを使用し、慎重にチャンバーの底をスクラブ。その後、蒸留水で洗浄し、再塗装の前にチャンバーを乾燥させる。
- 金属カッターで小片（8つのブレードから）に両刃のカミソリの刃をカット。
2。溶液の調製
- ソリューションの構成は、種に依存します。両生類のため、リンゲルは（ミリモル/ L）を持っている：110のNaCl、2.5 KClを、1.6のMgCl 2、1のCaCl 2、5 HEPES、pH値= 7.55。 pHはNaOHで最終的な値に調整する必要があります。哺乳類の場合は、リンゲルは（ミリモル/ Lで）持っています：130塩化ナトリウム、5のKCl、0.5のMgCl 2、2のCaCl 2、25 hemisodium - HEPES、pH値= 7.40を。リンゲル溶液は数ヶ月、室温で十分に密封保管することができます。
- 細菌の増殖を避けるために、-20℃に保たれた株式のグルコース溶液、1モル/ L、。
- 実験日に、5ミリモル/ Lの最終濃度にリンゲル液にブドウ糖を追加する一日の終わりには、リンゲルそれは細菌の成長可能性があるため、グルコースを含むことを捨てる。
3。網膜の単離
- 網膜の適切な切除のためには、動物を犠牲にする前に少なくとも2-3時間のために暗順応することが重要です。動物は暗い部屋で、適切な換気コンテナに暗順応してください。
- ハーフウェイリンゲル液を持つ2つの35ミリメートルのペトリ皿を埋める。
- 暗赤色灯の下で動物を犠牲にして目を削除する。その後、すべての手続きは、解剖顕微鏡またはビデオモニターとカメラを用いて赤外光下で実施されています。
- 眼の外表面から、残った組織を取り除きます。前部をカットして削除し、リンゲルで満たされたペトリ皿の一つにアイカップを移す。
- 硝子体を取り外し、慎重にオフはさんだり、任意の添付ファイルをカットすることでアイカップの残りの部分から網膜を分離。ゆっくりと網膜を持ち上げ、アイカップから完全に分離する。
- プラスチック製のトランスファーピペットで2ペトリ皿に網膜を転送する。遮光ボックスで網膜を含む料理をしてください。
4。単一視細胞の分離
- すべての手順は、赤外光下で実施されています。網膜の小片を切り取り、Sylgard覆われた皿にプラスチック製のピペットでそれを転送する。網膜の一部を含む溶液の体積は約250μLにする必要があります。
- ブレードホルダーとカミソリの刃の小片をつかむ - ブレードのエッジがホルダーに約45 °の角度になっているはず。 Sylgard層上に網膜の部分を平らにして、Sylgard層に付着保ちながら、ブレードが細かく網膜の一部を切る使用。
- 実験室に細胞を含む溶液200μLを転送する - Sylgardに覆われた皿に網膜の残りの部分を残す。遮光ボックスに単離された細胞でチャンバーを保つ。
- リンゲルの2-3 mLを追加し、解決するために細胞を10分間待ちます。この段階で、分離した細胞を色素ローディングプロトコルに応じて特定の蛍光色素（例えばフラ-2の場合）をロードすることができます。
- 細胞は、現在の実験のために顕微鏡のステージに撮影することができます。
5。蛍光イメージング
- 落射蛍光顕微鏡のステージにチャンバーを転送する。液灌流、温度プローブ、赤外線照明、等を調整する
- カーテンを閉じて、実験を開始。顕微鏡ケージの中にある赤外光をオンにする、実験室の底部に焦点を当て、そして細胞を探してステージを移動します。
6。代表結果S：
図。 1は、サンショウウオ（Ambystoma tigrinum）網膜からこのプロトコルを用いて得られた健康な分離株桿体と錐体の光受容体の形態を示しています。サンショウウオの細胞は、サイズが大きいためと網膜から単離後数時間のために生き残るために彼らの能力の単一細胞蛍光イメージング研究のために広く使用されている。さらに、サンショウウオの網膜から一は、定期的にロッドと錐体光受容体の両方を取得することができます。
細胞の健康のための一つの重要な基準はそのまま楕円体（ 図1）、ミトコンドリアが密集している細胞の一部の存在です。細胞はDAPI光学系の下に表示されているときに、ミトコンドリアのこの濃度は、NADHの存在に起因する強い蛍光シグナル（ 図2）を与える。無傷の楕円体の欠如は、実験のための一般的に不適当損傷した細胞のサインです。 図。図3は、腫れ細胞体と凝縮核に、損傷したサンショウウオ桿体光受容器を示しています。このような細胞は、はるかに低い蛍光DAPI光学系の下が表示されますが、FITC光学系で観察楕円領域に強いFADの信号を（酸化フラビンモノヌクレオチドとflavoproteinsから発信される）を示す。分離された光受容体の健康のためのもう一つの基準は、光による刺激の際、外側のセグメント中の全トランスレチノール（ビタミンA）を生成する能力です。ビタミンの世代は、無傷の代謝機構に依存するNADPH、かなりの量を必要とします。図4および図5は、それぞれそのままカエルやマウスの桿体の外節にビタミンの形成を示しています。
図1。健康なシングル桿体と錐体光受容体。細胞は、トラフサンショウウオ網膜から単離した。光情報伝達は、外側のセグメントで行われ、楕円体は、密にミトコンドリアが詰まっています。ロッドは、薄暗い光のビジョン、明るい光のビジョンのための円錐形のための責任があります。
図2。生活サンショウウオロッドとコーンの蛍光。これらは暗順応細胞である、それぞれの楕円体とは有意なビタミンで、その外側のセグメントで蛍光を強いNADHの蛍光を示す。蛍光画像の取り込みは、暗順応の期間後の可視光への最初の暴露を表しています。
図3。損傷したサンショウウオ桿体光受容器。腫れ細胞体と凝縮核が損傷を示すものである。細胞が酸化し、最小限のNADHの信号（DAPI光学系）があるが、はるかに強いFADの信号（FITC光）される。
図4。 NADHとレチノールとカエルロッド。これは、楕円体領域で強力なNADHの蛍光を示す健康なカエルの棒の光受容体である。露光する前に外側のセグメントで最小の蛍光がある。露光に続いて、ためにビタミンAの形成に外側のセグメントの蛍光の顕著な増加がある
図5。レチノールとマウスロッド。これは、健康なマウスの桿体光受容器は、マウスの桿体の楕円の領域は、強い蛍光シグナルを表示しないため、ビタミンAの形成に露光した後、かなりの外側のセグメントの蛍光を示している。
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Discussion
健康な単離された細胞が得られない場合、問題は、網膜の分離や健康状態、またはそのチョッピングのいずれかである。一般的に、眼と硝子体の前部を除去した後、網膜は容易に色素上皮をオフに持ち上げる。表示されない場合は、アイカップの周囲から始まるoffにはがしてみてください。それは分離することは依然として困難である場合は、おそらく可能性は、動物が時間の十分な期間のために暗順応されていない、または赤色の光が明るすぎるということです。動物のための適切な暗順応、および暗赤色灯を確認してください。網膜の桿体の存在は、単離網膜の色をチェックすることによって簡単に知ることができる。網膜の小片をカットし、室内の照明下で観察することができる独立したペトリ皿にそれを転送する。桿体を含む網膜の部分は明るい赤色（ロドプシンのために）急速にフェードことがあります。無色の部分は、ロドプシンの不在を示し、それゆえ桿体のでしょう。これは、色素上皮から網膜の不適切な分離や不健康な網膜が原因である可能性があります。このようなケースでは、動物の健康とその適切な暗順応を確認する必要があります。健康な網膜のではなく、健康な単離された細胞が得られる場合、問題はチョッピングで最も可能性があります。細かいチョッピングが重要です：チョッピングが粗すぎる場合、または網膜の非固定になると、それは網膜の部分の代わりに単離された細胞で主にもたらす。良いチョッピングは、通常、ソリューションに表示されるセルの"クラウド"をもたらす。
単一の光受容細胞の蛍光イメージングは、リアルタイムでの生理学的プロセスの広い範囲を調べるために、そのようなNADH、FADやビタミンなどの内因性の細胞の蛍光体だけでなく、さまざまな要因に感受性蛍光色素を使用することができます。メソッドは、サンショウウオ（Ambystoma tigrinum）17,18とカエル（ ヒョウガエル ）20、トカゲ（ ヤモリヤモリ ）21、魚類（ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュ ）11、およびマウス（ ハツカネズミなどの両生類も含め、多くの異なる種に適用することができます。 筋 ）22。マウス細胞へのメソッドの拡張子は遺伝子改変動物の様々なタイプの研究が可能になります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
NEI助成金EY014850によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources andinfrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools(scissors, forceps, blade holder) | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
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