Summary
इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry का उपयोग करने के लिए मध्यम बाध्यकारी समानताएं के साथ जैविक प्रणालियों के लिए बाध्यकारी ऊष्मा की निगरानी के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है.
Abstract
इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry (आईटीसी) एक बाध्यकारी प्रतिक्रिया की पूरी thermodynamic तस्वीर को समझने के लिए एक उपयोगी उपकरण है. जैविक विज्ञान, macromolecular बातचीत सेल की मशीनरी को समझने में आवश्यक हैं. बफर और तापमान के रूप में में प्रायोगिक स्थिति, विशेष रूप से बाध्यकारी अध्ययन किया जा रहा प्रणाली के अनुरूप किया जा सकता है. हालांकि, सावधान योजना के बाद से कुछ ligand और macromolecule एकाग्रता पर्वतमाला उपयोगी डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं की जरूरत है. Macromolecule और ligand की सांद्रता सही विश्वसनीय परिणामों के लिए निर्धारित किया की जरूरत है. केयर भी जब नमूनों की तैयारी के रूप में दोष काफी प्रयोग को प्रभावित कर सकते हैं लिया जाना चाहिए. जब नियंत्रण के साथ साथ आईटीसी प्रयोगों, ठीक से प्रदर्शन कर रहे हैं, stoichiometry आत्मीयता, और तापीय धारिता के रूप में उपयोगी बाध्यकारी जानकारी, प्राप्त कर रहे हैं. अलग बफर या तापमान की स्थिति के तहत अतिरिक्त प्रयोगों चल करके, सिस्टम के बारे में अधिक विस्तृत जानकारी प्राप्त की जा सकती है. एक आईटीसी प्रयोग के बुनियादी सेटअप के लिए एक प्रोटोकॉल दिया है.
Protocol
इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry (आईटीसी) एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है कि एक प्रयोग में एक बाध्यकारी बातचीत के thermodynamic के मापदंडों (आत्मीयता, तापीय धारिता और stoichiometry) निर्धारित कर सकते हैं 1 आईटीसी इज़ोटेर्माल शर्तों के तहत एक दूसरे reactant में एक reactant titrating काम करता है. मापा संकेत या जारी की बातचीत दो reactants (बंधन) पर अवशोषित गर्मी है. इंजेक्शन की एक श्रृंखला प्रदर्शन किया और गर्मी संकेत शून्य दृष्टिकोण के रूप में सीमित reactant संतृप्त हो जाता है. इज़ोटेर्म की फिटिंग thermodynamic के पैरामीटर देता है. कई समीक्षाएँ उपलब्ध है कि डेटा संग्रह और विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह के रूप में गणित इंस्ट्रूमेंटेशन का वर्णन कर रहे हैं 2,3 जबकि अन्य calorimeters उपलब्ध हैं (सबसे विशेष रूप से छोटे संस्करणों के साथ 200 आईटीसी), यहाँ हम VP-आईटीसी के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल का वर्णन निर्मित (अब जीई हेल्थकेयर का हिस्सा) MicroCal द्वारा.
1. तैयारी नमूने
- आदेश में और बफर में macromolecule ligand तैयार करने के लिए, कुछ संभावित मुद्दों को संबोधित करने की आवश्यकता है. सटीक फिट बैठता macromolecule के उचित सांद्रता, प्रजाति है कि आम तौर पर आईटीसी का नमूना सेल, और ligand में चला जाता है, इंजेक्शन सिरिंज में प्रजातियों की आवश्यकता है. क्योंकि कुछ प्रोटीन इंजेक्शन सिरिंज में प्रजातियों के लिए आवश्यक उच्च सांद्रता में कुल, सबसे अक्सर प्रोटीन नमूना सेल में भरी हुई है. इष्टतम macromolecule एकाग्रता 'ग' प्रणाली की भविष्यवाणी की आत्मीयता के उत्पाद, जो orthogonal तरीकों से पहले आईटीसी का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है और कुल macromolecule एकाग्रता, से निर्धारित किया जाता है जहां ग कश्मीर = एक * [ एम] से 1-10, 1 ग श्रृंखला के इष्टतम मूल्यों हालांकि यह संभव है ग कम सीमा से नीचे मूल्यों के साथ विशिष्ट प्रयोगात्मक शर्तों के तहत कमजोर बाध्यकारी सिस्टम के लिए सही डेटा प्राप्त 4 इस प्रकार, macromolecule एकाग्रता इस रेंज के साथ निर्धारित किया जाना चाहिए मन में ग मान (यानी, एक कश्मीर के लिए 10 6 एम -1 के एक, 10 से 1000 सुक्ष्ममापी की macromolecule सांद्रता इस्तेमाल किया जाना चाहिए) . प्रणाली के बंधन आत्मीयता के पिछले ज्ञान की मदद कर सकते हैं आईटीसी प्रयोग के बेहतर डिजाइन के माध्यम से आईटीसी के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन कम से कम. ligand की एकाग्रता काफी बड़े (7-25 गुना अधिक कमजोर ligand बाध्यकारी साइट के लिए कश्मीर घ से केंद्रित) हो सकता है ताकि संतृप्ति अनुमापन के आधे के लिए पहले तीसरे के भीतर होता है चाहिए. डेटा का सटीक फिटिंग भी संकेत के संतृप्ति की आवश्यकता है. उच्च बाध्यकारी आत्मीयता के साथ सिस्टम के लिए एक ligand एकाग्रता कम संतृप्ति भी अनुमापन में जल्दी से बचने के लिए, जो गलत फिट बैठता दे देंगे करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. एक बार कमजोर पड़ने नियंत्रण की गर्मी (बफर में ligand यानी अनुमापन) अनुमापन से घटाया गया है, संतृप्ति पर तापीय धारिता शून्य दृष्टिकोण चाहिए.
- क्योंकि छोटे अणु दोष आईटीसी माप में artifactual संकेतों को जन्म दे सकता है, यह सबसे अच्छा है, यदि संभव हो, कि macromolecule और ligand exhaustively बफर के खिलाफ dialyzed हो. वैकल्पिक रूप से, कॉलम क्रोमैटोग्राफी, स्पिन स्तंभों desalting, या बफर मुद्रा केन्द्रापसारक फिल्टर (उदाहरण के लिए, Centricons) macromolecule के बफर बदलने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि ligand के एक छोटे अणु है, यह डायलिसिस बफर का उपयोग कर छोटे अणुओं के लिए उपयुक्त है (यानी 100-500 / स्पेक्ट्रा पोर फ्लोट एक Lyzer के लिए दा cutoffs के साथ डायलिसिस झिल्ली के खिलाफ dialyzing बाद macromolecule के द्वारा किया गया dialyzed है या तैयार किया जा सकता है ). Ligand और macromolecule समाधान के बीच बफर संरचना में अंतर के नमूनों में दोष के कमजोर पड़ने की गर्मी से कलाकृतियों संकेत का नेतृत्व कर सकते हैं. तैयारी के बाद, यकीन है कि बफर macromolecule, ligand और मैच की तापीय धारिता में कलाकृतियों के रूप में पीएच (± 0.05 पीएच इकाइयों) protonation प्रभाव बफर के कारण पैदा कर सकते हैं बनाने की जांच 5 प्रत्येक प्रजातियों में से पर्याप्त तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें. तीन प्रतियों प्रयोगों और एक कमजोर पड़ने नियंत्रण के लिए, आवश्यक सामग्री की राशि इस्तेमाल किया आईटीसी पर निर्भर करेगा. लेकिन, सबसे आईटीसी उपकरणों है कि लगभग 2 मिलीलीटर मात्रा नमूना कोशिकाओं के लिए, macromolecule समाधान के कम से कम 6-7 मिलीलीटर की जरूरत हो जाएगा और आसानी से 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूबों में तैयार कर सकते हैं. 300 μL इंजेक्शन सीरिंज के लिए समाधान के 1-2 मिली पर्याप्त हो सकता है, और चाहिए या तो बाज़ ट्यूब या microcentrifuge ट्यूब में तैयार किया जा सकता.
- धूल, और अन्य particulates, आईटीसी thermogram के आधारभूत में कलाकृतियों का कारण बन सकती है. यह आवश्यक है कि वे पहले प्रयोग चल रहा है हटाया जा रहा है. नमूना स्टॉक समाधान की तैयारी के बाद, नमूने १४००० समाधान में गोली कणों को RPM को 8000 में पांच मिनट के लिए microcentrifuge ट्यूबों में centrifuged होना चाहिए. निकालें सतह पर तैरनेवाला, गोली को परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है, और यह एक नया ट्यूब / बाज़ microcentrifuge में जगह.
यदि reductants कम cysteines बनाए रखने की जरूरत है, कम सांद्रता और ताजा β-Merca के शेयरों का उपयोगptoethanol ((tris 2 carboxyl) phosphine) TCEP या dithiothreitol किसी भी reductant ऑक्सीकरण की वजह से कलाकृतियों को कम करने के लिए. इसके अलावा, बफर में कार्बनिक सॉल्वैंट्स की उपस्थिति (कुछ छोटे अणु ligands कि मेथनॉल या DMSO की जरूरत है क्रम में घुलनशील हो सकता है के लिए आम) संकेत कलाकृतियों पैदा कर सकता है. यदि कार्बनिक सॉल्वैंट्स ligand के लिए आवश्यक हैं, तब macromolecule समाधान भी एक ही एकाग्रता शामिल किसी भी कार्बनिक विलायक के कमजोर पड़ने की गर्मी से उत्पन्न होने वाले संकेत से बचने के लिए करना चाहिए. Ligand और cosolvents करने के लिए कारण macromolecule के बीच बफर संरचना में थोड़ा सा अंतर, लवण या पीएच नमूनों की तैयारी के दौरान संभव हो रहे हैं. यह सबसे अच्छा है के लिए नमूना या macromolecule में नमूना बफर बफर में ligand के कमजोर पड़ने की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि गर्मी बफर सामग्री में अंतर से उत्पन्न होने वाले संकेतों केवल कलाकृतियों से उत्पन्न होने वाले डेटा का कारण नहीं है. - Macromolecule और ligand ध्यान से आपके सिस्टम के लिए उपयुक्त तकनीक (जैसे absorbance के माप, HPLC, वर्णमिति assays, बीसीए assays के लिए प्रोटीन, आदि) का उपयोग करने के लिए अपने सटीक सांद्रता रिकॉर्ड की सांद्रता की जाँच करें. वास्तविक एकाग्रता और इज़ोटेर्म फिट किया एकाग्रता में अंतर stoichiometry, तापीय धारिता और बाध्यकारी आत्मीयता के प्रयोग से निर्धारित में त्रुटियों का कारण होगा. संकेत उच्च तापमान पर विशेष रूप से हवाई बुलबुले या टाइट्रेट करना के दौरान भंग गैसों की रिहाई की वजह से कलाकृतियों, से बचने के यह नमूने Degas के लिए आम है.
2. प्रयोग की स्थापना
- सुनिश्चित करें कि नमूना सेल और इंजेक्शन सिरिंज निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार पहले macromolecule और ligand लोड हो रहा है साफ कर रहे हैं. नमूना सेल हैमिल्टन (हैमिल्टन सिरिंज प्रति बैरल के रूप में आसानी से टूट गया है या सुई तुला के साथ देखभाल का उपयोग करें) सिरिंज का उपयोग आसुत पानी के 1.8 मिलीलीटर के साथ दो या तीन बार कुल्ला. अगला नमूना सेल बफर की 1.8 मिलीलीटर के साथ कई बार कुल्ला. Macromolecule समाधान के 1.8 मिलीलीटर के साथ नमूना सेल लोड बुलबुला गठन से बचने के सावधान किया जा रहा है.
- आसुत जल के साथ सेल संदर्भ भरें. सबसे बफ़र्स के लिए, आसुत जल संदर्भ समाधान के रूप में उपयोग करने के लिए ठीक है. हालांकि, विशेष रूप से उच्च ईओण ताकत या osmolality के साथ buffers के लिए, यह बेहतर है एक संदर्भ के रूप में बफर का उपयोग.
- संदर्भ और नमूना हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर कक्षों से हवाई बुलबुले निकालें. धीरे सेल के पक्ष किसी भी बुलबुले कि सेल के नीचे हो सकता है और अच्छी तरह से सेल के शीर्ष करने के लिए जुड़ा हो सकता है दस्तक ऊपर और नीचे सिरिंज सुई चाल है. नमूना और संदर्भ कोशिकाओं से किसी भी अधिक मात्रा निकालें.
- इंजेक्शन सिरिंज का उपयोग कर टयूबिंग के भरण बंदरगाह के लिए एक प्लास्टिक सिरिंज संलग्न. आसुत जल के साथ इंजेक्शन सिरिंज कुल्ला. बफर कुल्ला द्वारा पालन करें. यकीन है कि इंजेक्शन सिरिंज प्रणाली के माध्यम से हवा ड्राइंग द्वारा पूरी तरह से खाली है. Ligand के समाधान में इंजेक्शन सिरिंज की सुई प्लेस और इंजेक्शन सिरिंज में ligand समाधान आकर्षित पूरे सिरिंज तक भरा हुआ है. बंदरगाह में एक छोटे से अतिरिक्त मात्रा (लगभग 50 μl या अधिक) और संलग्न टयूबिंग ड्राइंग जारी रखें. तुरंत सिरिंज के भरण बंदरगाह बंद करो और टयूबिंग और प्लास्टिक सिरिंज अलग. पर्ज और इंजेक्शन सिरिंज दो से अधिक बार फिर से भरना करने के लिए सिरिंज से किसी भी बुलबुले को दूर. Ligand के समाधान से सिरिंज निकालें और किसी भी बूँदें हटाने kimwipe के साथ पक्ष पोंछ, सावधान किया जा रहा नहीं kimwipe सिरिंज टिप के रूप में इस सिरिंज से मात्रा निकाल सकते हैं स्पर्श. इसके अलावा, दस्तक नहीं या सिरिंज जार के रूप में यह भी मात्रा की सिरिंज सिरे से नुकसान हो सकता है सावधान रहना. नमूना सेल में इंजेक्शन सिरिंज रखें.
- आईटीसी को चलाने के लिए पैरामीटर सेट करें. मजबूत गर्मी संकेतों के साथ बाध्यकारी सिस्टम के लिए, कम मात्रा इंजेक्शन की एक बड़ी संख्या में फिटिंग के लिए और अधिक डेटा बिंदु (जैसे 3 μl के 75 इंजेक्शन) दे देंगे. सिस्टम है कि कमजोर गर्मी संकेतों के लिए, बड़ी मात्रा में इंजेक्शन की एक छोटी संख्या में बेहतर कर रहे हैं (जैसे 8 μl के 33 इंजेक्शन). सबसे अधिक, उच्च इंजेक्शन संस्करणों के साथ कम इंजेक्शन इस्तेमाल किया जाता है. यह कई titrations लेने के लिए अनुकूलन की स्थिति है कि आपके सिस्टम के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं हो सकता है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि बंधन तापीय धारिता या तो एक्ज़ोथिर्मिक या endothermic कर सकते हैं अध्ययन किया जा रहा प्रणाली के आधार पर है. दुर्भाग्य से, कुछ सिस्टम कम गर्मी का संकेत है, प्रतिक्रिया की गर्मी के लिए तय कर पाना मुश्किल बना. ऐसी प्रणालियों के साथ कोई समस्या संभावित macromolecule की एकाग्रता बढ़ रही है, प्रयोग (बाध्यकारी प्रणाली की गर्मी की क्षमता पर निर्भर करता है), और / के तापमान में परिवर्तन या पीएच या बफर के ईओण ताकत फेरबदल के द्वारा दूर किया जा सकता है.
- इसके अलावा प्रत्येक इंजेक्शन के बीच समय रिक्ति पर विचार करें. यह आवश्यक है कि ligand के प्रत्येक इंजेक्शन के बाद, सिस्टम को संतुलित समय दिया जाता है और आधारभूत की गर्मी संकेत देता है अगले इंजेक्शन से पहले होता है. सबसे प्रणालियों, तीन से पांच मील के लिएnutes पर्याप्त होना चाहिए. इंजेक्शन के बीच सिस्टम जहां संतुलन पांच मिनट के भीतर घटित नहीं करता है के लिए समय बढ़ाया जाना चाहिए.
- क्योंकि वहाँ कुछ और इंजेक्शन सिरिंज में macromolecule ligand समाधान के बीच मिश्रण हो सकता है एक बार यह नमूना सेल में डाला जाता है, पहला इंजेक्शन नकली परिणाम दे देंगे. यह सबसे अच्छा है पहले एक या दो इंजेक्शन (ताकि वे बाद में खारिज किया जा सकता है) के लिए छोटे मात्रा (जैसे μl 2) का उपयोग करें और वांछित मूल्यों पर बाद इंजेक्शन रखने के लिए.
- (25 के साथ प्रयोग के तापमान डिग्री सेल्सियस सबसे आम किया जा रहा है, हालांकि 2 और 80 के बीच तापमान डिग्री सेल्सियस में इस्तेमाल किया जा सकता है). चुनें यह सबसे अच्छा है एक तापमान है कि अन्य प्रयोगों (बंधन, कैनेटीक्स, आदि) ligand-macromolecule प्रणाली पर प्रदर्शन मैच चुन. आईटीसी स्थापित किया जा सकता है प्रयोग के तापमान से एक अलग तापमान पर संतुलित. अगर प्रयोग करने के लिए एक के तापमान पर अधिक से अधिक 10 ° कमरे के तापमान से दूर सी में प्रदर्शन किया जा रहा है, तो यह सबसे अच्छा है के भीतर 5 साधन ° प्रयोगात्मक तापमान के सी के लिए संतुलन तापमान सेट. इस बार साधन प्रयोग के तापमान तक पहुँचने के लिए ले जाएगा कम हो जाएगा.
सिरिंज की सरगर्मी गति भी विचार किया जाना चाहिए. भावप्रवण ligand और अनुमापन के दौरान macromolecule की पर्याप्त मिश्रण के लिए आवश्यक है, लेकिन कुछ प्रोटीन तेजी से सरगर्मी से अस्थिर कर रहे हैं. इन मामलों के लिए, क्रियाशीलता गति एक अपेक्षाकृत कम दर पर सेट किया जाना चाहिए. एक बार प्रयोगात्मक सभी मापदंडों सेट है, तो प्रयोग शुरू किया जा सकता है. - एक बार प्रयोग खत्म हो गया है, आईटीसी निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार साफ किया जा सकता है. प्रयोग के अंत में नमूना सेल में समाधान अगर macromolecule ligand जटिल मिश्रण पर अतिरिक्त प्रयोगों वांछित हैं रखा जा सकता है.
- Titrations कम से कम एक या दो से अधिक बार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त करने के लिए दोहराएँ. एक नियंत्रण जहां ligand बफर में नमूना सेल में titrated है ligand के लिए कमजोर पड़ने की गर्मी निर्धारित चलाएँ. कुछ सिस्टम जहां सहकारी बंधन, बंधनकारी प्रक्रिया के बारे में अतिरिक्त जानकारी है के लिए ligand में macromolecule इंजेक्शन लगाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. विभिन्न इंजेक्शन झुकाव अतिरिक्त जानकारी है, जो वैश्विक फिटिंग के लिए सहायक हो सकता है दे 6 कर सकते हैं .
3. डेटा का विश्लेषण
- डेटा की फिटिंग आसानी से किसी भी डेटा ढाले कार्यक्रम (आमतौर पर साधन के साथ निर्माता द्वारा आपूर्ति की) में मैक्रोज़ का उपयोग कर प्रदर्शन कर सकते हैं. पहले डेटा फ़ाइल लोड. हवा में बुलबुले या अन्य कलाकृतियों संकेत के किसी भी लक्षण के लिए कच्चे thermogram की जाँच करें. अगर वहाँ किसी भी कलाकृतियों (जैसे आधारभूत या चोटियों जब वहाँ था उस समय के बिंदु पर कोई इंजेक्शन में spikes के रूप में) हैं, तो इन डेटा बिंदुओं को ध्यान दें के रूप में वे हटाया जाना चाहिए. अगला, ligand के कमजोर पड़ने नियंत्रण डेटा लोड है, और बाध्यकारी इज़ोटेर्म ligand के कमजोर पड़ने से डेटा घटाना. इस समय, सभी नकली डेटा बिंदुओं पहले एक या दो अनुमापन जहां कमजोर पड़ने कलाकृतियों होते हैं के डेटा बिंदुओं (चरण 7 देखें) सहित, निकालें.
- डेटा ढाले (एक बाध्यकारी साइट, दो / एकाधिक बाध्यकारी साइटों, सहकारी बंधन, आदि) मॉडल डेटा को फिट करने के लिए इस्तेमाल किया जा चुनें. डेटा मानकों फिटिंग, stoichiometry (एन), तापीय धारिता (ΔH) और बाध्यकारी आत्मीयता के प्रारंभिक अनुमान के साथ फिट किया जा सकता है है (कश्मीर ). यदि बंधन आत्मीयता, या अन्य मापदंडों के पूर्व ज्ञान, orthogonal प्रयोगों से जाना जाता है, तो इन मूल्यों में प्रवेश किया जा सकता है. यह फिटिंग के दौरान स्थानीय minima में फंस बनने फिट से बचने में मदद करता है. एक बार डेटा पहली टाइट्रेट करना के लिए फिट किया गया है, isotherms के बाकी के लिए 15 कदम और 16 दोहराएँ. वैकल्पिक रूप से, डेटा दुनिया भर में SEDPHAT के रूप में इस तरह के कार्यक्रमों का उपयोग कर फिट किया जा सकता है 6 SEDPHAT त्रिगुट जटिल डेटासेट के साथ संयोजन में द्विआधारी जटिल डेटासेट (यानी अणुओं एक + B) के वैश्विक फिटिंग में विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है. (अणुओं A + B + सी). उदाहरण के लिए, अणु सी के एक अटल बिहारी जटिल बंधन में, यह हमेशा स्पष्ट नहीं है कि क्या वहाँ किसी भी सी के एक या बी के एक (यदि पूरी तरह से संतृप्त नहीं है) करने के लिए बाध्य कारण संकेत हो सकता है.
- यह सुनिश्चित करें कि आईटीसी डेटा artifactual नहीं कर रहे हैं करने के लिए, बंधन आत्मीयता और आईटीसी से प्राप्त stoichiometries एक orthogonal विधि के साथ तुलना किया जाना चाहिए 7,8 इसके अतिरिक्त, आईटीसी तापीय धारिता मान van't Hoff साजिश से तापीय धारिता के लिए तुलना में किया जा सकता है. 9 यह भी मददगार साबित करने के लिए ligand या macromolecule के अलग सांद्रता का उपयोग कर सकते हैं गर्मी संकेत के निरपेक्ष मूल्य के रूप में बढ़ती macromolecule एकाग्रता के साथ वृद्धि करनी चाहिए. कलाकृतियों सबसे उठता है अगर सेल और सिरिंज में बफ़र्स नहीं मिलान कर रहे हैं की संभावना है. कलाकृतियों के लिए एक और संभावना अशुद्ध नमूने से उठता है.
- हम अनुशंसा करते है कि सरल द्विआधारी जटिल titrations उपयोगकर्ता के साथ शुरू जिसके लिए वहाँ पर पिछले जानकारी उपलब्ध कश्मीर घ और stoichiometry. फिर, अगर अतिरिक्त ligands बाँध, उपयोगकर्ता और अधिक जटिल त्रिगुट जटिल titrations की कोशिश, ligand सांद्रता varying कर सकते हैं, और शायद सिरिंज और सेल घटक स्विचन. त्रिगुट जटिल गठन के लिए दोनों रास्तों के लिए enthalpies की तुलना additive के रूप में तापीय धारिता एक राज्य समारोह है चाहिए. 10 फिर, 6 SEDPHAT यहां काफी उपयोगी हो जाने की संभावना है.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1. Cofactor NADPH ई. के लिए बाध्य के लिए एक अच्छी तरह से अनुमापन व्यवहार का एक प्रतिनिधि उदाहरण कोलाई गुणसूत्र dihydrofolate रिडक्टेस (ecDHFR). पैनल (एक) कच्चे thermogram से पता चलता है, (बी), एकीकृत thermogram फिट से बाध्यकारी इज़ोटेर्म एक साइट उत्पत्ति सॉफ्टवेयर में मॉडल का उपयोग कर, और (सी) इज़ोटेर्म के फिट SEDPHAT से के साथ एक बंधनकारी साइट मॉडल का उपयोग फिट बच के साथ. उत्पत्ति सॉफ्टवेयर से, एक साइट बंधन मॉडल का उपयोग, n = 1.09 ± 0.02, कश्मीर घ = 0.194 ± 0.001 सुक्ष्ममापी, ΔH = -22.7 ± 0.4 kcal / mol, TΔS = -13.1 ± 0.4 किलो कैलोरी / mol, और ΔG = - 9.16 ± 0.01 किलो कैलोरी / mol. Sedphat 0.94 की एक n वहन का उपयोग डेटा के फिट बैठता है ± 0.01, 0.195 के एक कश्मीर घ ± 0.013 ΔM, -22.5 के ΔH ± 0.2 किलो कैलोरी / mol -13.39 की TΔS kcal / mol और -9.15 किलो कैलोरी / mol के ΔG .
Discussion
आईटीसी प्रोटीन ligand पर 12 13 के डीएनए-ligand और आरएनए macromolecule 14 अध्ययन तलाश में, पढ़ाई के साथ ligand macromolecule बातचीत, 11 अध्ययन में किया गया है बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया. आईटीसी भी नैनोकणों जैसे ठोस सामग्री, है कि वर्दी के निलंबन के फार्म के साथ चला सकते हैं 15 इसके अलावा, त्रिगुट प्रणाली, जहां पहले से ही एक ligand macromolecule करने के लिए बाध्य है और एक दूसरे ligand titrated की ऊष्मा का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लिए, उदाहरण के लिए, सब्सट्रेट के एक एंजाइम cofactor प्रणाली के लिए बाध्य 7 अध्ययन भी बहुत ही उच्च बाध्यकारी समानताएं है कि सामान्य रूप से कमजोर बंधन ligands के साथ प्रतिस्पर्धा बाध्यकारी assays के प्रदर्शन से आईटीसी का पता लगाने सीमा से अधिक के साथ अणुओं के लिए कर सकते हैं प्रदर्शन किया जा कमजोर बंधन पर 16. ligands प्रतियोगिता assays के द्वारा भी प्राप्त किया जा सकता है! 17 बंधन में पानी की भूमिका विलायक पुनर्गठन पर तापीय धारिता की निर्भरता के साथ आईटीसी, 18 के द्वारा पता लगाया जा सकता है. 19 हाल ही में, DNAK वेरिएंट के गठनात्मक परिवर्तन के ऊष्मप्रवैगिकी के बंधन पर मापा गया ADP और एटीपी 20 प्रोटीन प्रोटीन संघ आईटीसी द्वारा अध्ययन किया जा सकता है, असमलैंगिक 21 परिसरों पर होमोसेक्सुअल संघ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जानकारी उपज.. 22 पर तापमान के प्रभाव बाध्यकारी तापीय धारिता बाध्यकारी घटना की गर्मी क्षमता 2 की संख्या दे. प्रोटॉन अवशोषित या बाध्यकारी पर जारी ionization के विभिन्न enthalpies साथ बफ़र्स में प्रदर्शन प्रयोगों से निर्धारित किया जा सकता है 5. यदि अतिरिक्त आईटीसी अध्ययन अलग पीएच मान पर किया जाता है, तो शामिल समूह के pKa संभावित निर्धारित की. जा सकता है 23
संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, macromolecule और ligand की एकाग्रता की सटीक मापन एक अच्छा आईटीसी प्रयोग के लिए जरूरी हैं. नमूना सांद्रता भी एक उचित सीमा के भीतर होना करने के लिए विश्वसनीय डेटा प्राप्त की जरूरत है. केयर बफर के साथ लिया जाना चाहिए के रूप में छोटे अणु दोष और पीएच बेमेल thermogram में कलाकृतियों का कारण होगा.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम NSF MCB 0817827 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-282 | |
| 15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| 2.5 mL Hamilton syringe | MicroCal | SYN161714 |
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