Summary
使用温和的亲和力，以监测生物系统的结合热力学等温滴定量热的一个协议。
Abstract
等温滴定量热（ITC）是一个有用的工具，为了解一项具有约束力的反应的完整的热力学图片。在生物科学，大分子的相互作用是理解细胞的机制至关重要。实验条件，如缓冲区和温度，可以根据特定约束力的制度，正在研究。然而，细心的规划是必要的，因为某些配体和高分子浓度范围是必要的，以获取有用的数据。大分子与配体的浓度要准确可靠的结果，决定。护理也需要准备样品的杂质可以显著影响的实验时，应采取的。当ITC的实验与对照，正确执行的，有用的绑定信息，如化学计量学，亲和力和焓，得到。运行更多的试验，根据不同的缓冲区或温度条件下，可以得到更详细的信息，有关系统。一个协议是为一个国际贸易中心实验的基本格局。
Protocol
等温滴定量热（ITC）是一个完善的技术，可以决定在一个实验中的所有一项具有约束力的相互作用的热力学参数（亲和力，焓和化学计量学 ），1国贸中心工程由滴定成为第二个反应物，在等温条件下的反应物。测得的信号是两反应物的相互作用（绑定）后释放或吸收的热量。一系列的注射执行和限制反应物趋于饱和，热信号将趋近于零。等温线的拟合给出的热力学参数。一些评语是可用的仪器仪表以及数据收集和分析的数学描述。2,3虽然其他热量计（最显着的贸易中心与小卷 200），在这里，我们描述了一个一般的VP - ITC协议制造MICROCAL（现为GE医疗集团的一部分）。
1。准备样品
- 为了准备和缓冲高分子配体，一些潜在的问题需要加以解决。准确的适合需要适当浓度的高分子，通常在国际贸易中心的样品池，并配体的物种，在注射器的物种。由于某些蛋白质聚集在注射器中的物种所需要的高浓度，最常见的蛋白质是装入样品池。从“C”，产品的预测系统的亲和力，它可以采用正交的方法，使用国际贸易中心前估计，总高分子浓度，确定最佳的高分子浓度， 其中C = K A * [M]。 C范围内的最优值从10-1000，虽然它是弱结合系统的C -值低于下限具体的实验条件下得到准确的数据 。因此，高分子浓度必须确定此范围记C值（即10 6米-1的K，应采用高分子浓度10〜1000微米）。之前系统结合的亲和力知识可以帮助减少贸易中心的使用，通过更好的ITC实验设计蛋白质。配体的浓度应足够大（比K ð集中最弱的配体结合位点的7-25倍以上），饱和度，使发生在最初的三分之一到一半滴定。还需要准确的数据拟合信号的饱和度。对于具有较高的结合亲和力系统中，配体浓度较低的，应使用以避免饱和为时尚早滴定，这将给不准确的适合。一旦已减去滴定稀释控制热量（即到缓冲区配体滴定），在饱和焓应该趋近于零。
- 由于小分子杂质，可能会引起在国贸中心测量的artifactual信号，它是最好的，如果可能的话，大分子与配体尽数对缓冲区透析。另外，柱层析，脱盐离心柱，或缓冲液交换离心式过滤器（例如，Centricons）可以用来改变大分子的缓冲区。如果配体是一种小分子，它可以使用大分子后已与合适的截止时间为小分子（即100-500大一个光谱/ POR浮法一个仪透析对透析膜透析或透析缓冲准备）。缓冲液成分之间的配体和高分子解决方案的差异可能会导致信号稀释样品中杂质的热工件。经过准备，确保检查的缓冲区，高分子和配体匹配的pH值在焓文物（± 0.05 pH单位）可以引起缓冲质子效果。5确保足够的准备，每一个物种。一式三份实验和稀释控制，所需材料的数量将取决于所使用的国际贸易中心。但是，对于大多数的国贸中心仪器约2毫升的量样品细胞，至少高分子溶液6-7毫升将需要，并可以方便地在15毫升隼管准备。 1-2溶液300μL注射器，应足够，并可以在猎鹰管或离心管准备。
- 灰尘和其他微粒，可引起工件在国贸中心温度记录的基准。当务之急是，他们被删除之前运行实验。编制样本股的解决方案后，样品应在离心管离心五分钟到溶液中的沉淀颗粒在8000到14000 RPM。去除上清，小心，不要去打扰颗粒，并将其放置在一个新的猎鹰/离心管。
如果需要保持降低半胱氨酸还原剂是，使用低浓度的β-马尔卡和新鲜的股票ptoethanol，TCEP（三（2 - 羧基）膦）或二硫苏糖醇，以尽量减少由于还原剂氧化的工件。此外，在缓冲区的存在有机溶剂（常见的一些可能需要甲醇或DMSO以可溶性的小分子配体）可能会导致信号的文物。如果需要配体的有机溶剂，然后高分子解决方案还必须包含相同的浓度，以避免有机溶剂的稀释热所产生的任何信号。在缓冲区之间的配体和高分子因夹带剂成分的细微差别，盐或pH值是可能的样品制备过程中。最好的方法是检查进样缓冲或大分子的样品缓冲液的配体的稀释，以确保从缓冲区中的内容的差异所产生的热量信号不会导致数据单纯从文物产生。 - 检查高分子配体和谨慎地使用适合您的系统技术（如吸光度测量，高效液相色谱法，比色法，BCA法测定蛋白质等），记录它们的确切浓度的浓度。在实际浓度和使用，以适应等温线的浓度的差异会导致在化学计量学，焓和有约束力的亲和力，从实验确定的错误。德加样品，以避免由于气泡或溶解的气体在滴定释放的信号文物，特别是在较高温度下，是很常见的。
2。设立实验
- 确保样品池和注射器是根据制造商的协议清洗的装货前对大分子与配体。 1.8毫升蒸馏水使用汉密尔顿注射器（使用保健为每桶容易折断与汉密尔顿注射器或针头弯曲）的水冲洗样品池两次或三次。下一步冲洗样品池1.8缓冲液数次。高分子溶液1.8毫升，装入样品池，小心，以避免泡沫的形成。
- 用蒸馏水填充引用单元格。对于大多数缓冲区，蒸馏水是正常使用，作为对照品溶液。然而，对于具有特别高离子强度或渗透压的缓冲区，这是更好地利用缓冲区作为参考。
- 取出的样品使用汉密尔顿注射器参考和细胞的气泡。向上和向下的细胞敲任何气泡，可在单元格的底部和连接井细胞顶部的两侧，轻轻移动注射器针头。删除任何过剩体积的样品和参比细胞。
- 将一个塑料注射器的使用管注射器注射的填充端口。用蒸馏水冲洗注射器。按照缓冲区冲洗。确保注射器是完全按图纸通过系统内的空气疏散。放入配体的解决方案，注射器的针头和借鉴注射器配体的解决方案，直到整个注射器。继续绘制到的端口和连接管一点点多余的量（约50μL或更多）。立即关闭注射器填充端口和分离管和塑料注射器。清除和填充注射器两次从注射器中删除任何气泡。从配体解决方案中删除的注射器和一个kimwipe，以消除任何滴擦拭一边，小心不要触摸注射器尖端的kimwipe因为这可能会删除从注射器的体积。此外，要小心不要敲或jar注射器，这也可以造成损失量从注射器尖端。注射器放入样品池。
- 成立国际贸易中心的运行参数。对于具有较强的热信号约束力的系统，大量的低容量注射剂将给予更多的数据点（如75注射3μL）装修。系统有弱热信号，少数的大容量注射剂是可取的（如33 8μL注射）。最常见的，具有较高的注射量较少注射使用。这可能需要几个滴定，以优化的条件，是最适合您的系统。重要的是要注意的，具有约束力的焓可以放热或吸热，取决于正在研究的系统。不幸的是，有些系统具有低热量信号，使反应热难以确定。这种系统的问题可能会被克服增加大分子的浓度，改变温度的实验（取决于绑定系统的热容量），和/或改变pH值或离子强度的缓冲。
- 同时考虑每次注射之间的时间间隔。当务之急是，每个配体注射后，系统给定的时间来平衡和热信号返回未来注入发生前的基线。对于大多数系统，三到五英里nutes应该足够。之间的注射时间应增加系统的平衡，不会发生在五分钟内。
- 因为会有一些混合，一旦之间的高分子配体的解决方案和注射器插入进样细胞，第一次注射会给假的结果。最好使用小卷的第一个或两个注射剂（使他们可以在以后被丢弃）（如2μL）和所需的值保持在随后的注射。
- 选择实验的温度（以25 ° C是最常见的，虽然在2和80之间° C的温度可以使用）。这是最好的选择匹配高分子配体系统上执行的其他实验（绑定，动力学等）的温度。国际贸易委员会可设立在不同的温度，从实验的温度平衡。如果试验是在温度超过10℃远离室温，那么最好设置为平衡温度在5 ° C的实验温度的仪器。这将减少时间仪器将达到实验的温度。
注射器的搅拌速度也需要考虑。搅拌足够的滴定过程中的配体和高分子混合是必要的，但一些蛋白质是由不稳定的快速搅拌。对于这些情况，搅拌速度应设置在一个相对较低的利率。一旦所有的实验参数已经成立，那么就可以开始实验。 - 一旦实验完成后，ITC可根据制造商的协议清洗。如果所需的额外的高分子配体的复杂混合物的实验样品中的细胞在实验结束的解决方案，可以保持。
- 重复滴定至少有一个或两个以上的时间得到重复性的数据。运行控制配体是一个缓冲区，以确定为配体的稀释热滴定样品中的细胞。对于一些有约束力的合作更多的信息，对绑定过程的系统中，可以得到注入高分子配体。不同注射方向可以提供更多的信息，这可能有助于全球拟合。
3。分析数据
- 数据拟合，可以很容易地使用宏在任何数据拟合程序（通常是随着仪器的制造商提供）。装入第一个数据文件。检查原料温度记录信号中的气泡或其他文物的任何迹象。如果有任何构件（如当时没有在这个时间点注射在基线或峰峰值），然后记下这些数据点，因为他们应该被删除。接下来，负载配体稀释控制数据，并减去配体的结合等温线稀释数据。此时，删除所有虚假的数据点，包括第一个或两个数据点发生稀释文物的滴定（见步骤7）。
- 选择的数据拟合模型（结合位点，两个/多个结合位点，合作约束力等）被用来拟合数据。的数据可以配合的拟合参数，化学计量学（N），焓（ΔH）和亲和力（K 一 ）初始猜测。如果结合的亲和力，或其他参数的先验知识，是从已知的正交实验，然后可以输入这些值。这有助于避免的契合，成为被困在装修局部极小。一旦数据已符合第一滴定，重复步骤15和16等温线的其余部分。另外，数据可以适合全球使用SEDPHAT，如方案6 SEDPHAT可能是二进制复杂的数据集，结合三元复杂的数据集（即分子的A + B）的全球装修，特别是在有帮助（分子通过A + B + C）。例如，在C到一个AB的复杂的分子具有约束力，它并不总是很清楚是否有可能是由于C绑定的A或B的一个（如果A是不完全饱和）的任何信号。
- 为了确保国际贸易委员会的数据是不artifactual，应该从ITC得到的结合亲和力和化学计量比正交法7,8此外，ITC焓值可以比较从范特霍夫积焓。9它也可以证明是有益的的，使用不同浓度的配体或高分子的热信号的绝对值随着高分子浓度的增加应增加。文物最有可能出现在细胞和注射器的缓冲区，如果不匹配。另一个构件的可能性来自不纯的样品。
- 我们建议用户用简单的二进制复杂滴定开始，其中有以前的信息对K d和stoich提供iometry。然后，如果额外的配体结合，用户可以尝试更复杂的三元复合滴定法，不同的配体浓度，也许交换注射器和电池组件。为三元复合物的形成路径的焓的比较应添加剂作为焓是状态函数。，10，SEDPHAT 6可能会非常有用。
4。代表性的成果：
一个有代表性的例子为辅酶NADPH结合到 E乖巧的滴定图1 。 大肠杆菌染色体二氢叶酸还原酶（ecDHFR）。面板（*）显示的原料温度记录;，从集成热像适合的结合等温线（二）使用Origin软件在一个网站的模式;及（C）等温线的拟合使用一个具有约束力的网站模式，从SEDPHAT沿合适的残差。从原点软件，使用的一个网站绑定模型，N = 1.09 ± 0.02，K D = 0.194 ± 0.001μM，ΔH= -22.7 ± 0.4千卡/摩尔，TΔS= -13.1 ± 0.4千卡/摩尔，和ΔG= - 9.16 ± 0.01千卡/摩尔。适合数据使用Sedphat负担0.94 Ñ ± 0.01，K ð的0.195 ± 0.013ΔM，ΔH为-22.5 ± 0.2千卡/摩尔，-13.39TΔS千卡/ mol和-9.15千卡/摩尔的ΔG。
Discussion
ITC已广泛用于蛋白配体，12 DNA配体13和RNA 大分子的14项研究的研究与学习的配体大分子的相互作用，11。 ITC甚至可以运行，即形成均匀的悬浮固体材料，如纳米粒子。15此外，三元体系，其中一个配体已经绑定到高分子和滴定第二配体，可以被用来确定了热力学，例如，基板具有约束力一种酶的辅助因子的系统。研究还可以进行具有很高的亲和力，通常会超过执行竞争较弱的具有约束力的配体结合分析国际贸易中心的检测限为分子16。弱约束力的信息配体可以通过竞争分析17约束作用的水可以通过探索，随着溶剂重组焓的依赖国际贸易中心，18 19最近，DnaK的变种构象变化的热力学测定后绑定ADP和ATP，可以由国贸中心 20蛋白的蛋白质协会研究，产生异质复合物 21以及HOMO关联的信息 。22的结合焓温度效应会给绑定事件的热容量2的数量结合后吸收或释放的质子，也可以从不同的电离焓的缓冲区进行实验来确定。5，如果更多的国际贸易中心的研究是在不同pH值，那么有可能确定所涉及组的pKa 23。
总之，精确的测量大分子与配体的浓度是一个良好的国际贸易中心实验来说是必要的。样品浓度也需要一个适当的范围内内，以获得可靠的数据。护理应采取的缓冲区，小分子杂质和pH值不匹配，会造成在热谱文物。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持由NSF资助MCB - 0817827。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-282 | |
| 15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| 2.5 mL Hamilton syringe | MicroCal | SYN161714 |
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