Summary
Un protocollo generale per l'uso di calorimetria isotermica di titolazione per monitorare la termodinamica vincolante per i sistemi biologici con moderata affinità di legame è presentato.
Abstract
Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è uno strumento utile per comprendere il quadro completo termodinamico di una reazione vincolante. Nelle scienze biologiche, le interazioni macromolecolari sono essenziali per comprendere il meccanismo della cellula. Condizioni sperimentali, come il tampone e la temperatura, può essere adattato al particolare sistema di rilegatura in fase di studio. Tuttavia, un'attenta pianificazione è necessaria in quanto ligando alcuni intervalli di concentrazione macromolecola sono necessari per ottenere dati utili. Concentrazione della macromolecola e ligando devono essere accuratamente determinato per risultati affidabili. Cura deve anche essere presa durante la preparazione dei campioni come impurità possono influenzare significativamente l'esperimento. Quando gli esperimenti ITC, insieme ai controlli, vengono eseguite correttamente, utili informazioni vincolanti, come l'affinità stechiometria e entalpia, si ottengono. L'esecuzione di ulteriori esperimenti con tampone differenti o condizioni di temperatura, informazioni più dettagliate si possono ottenere informazioni sul sistema. Un protocollo per la configurazione di base di un esperimento ITC è dato.
Protocol
Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è una tecnica ben consolidata in grado di determinare tutti i parametri termodinamici (affinità, entalpia e stechiometria) di una interazione vincolante in un esperimento. ITC 1 opere per titolazione di un reagente in un secondo reagente in condizioni isoterme. Il segnale misurato è il calore rilasciato o assorbito in seguito all'interazione (vincolante) dei due reagenti. Una serie di iniezioni vengono eseguite e il segnale di calore si avvicinerà allo zero come il reagente limitante si satura. Montaggio della isoterma dà i parametri termodinamici. Sono disponibili diverse recensioni che descrivono la strumentazione e la matematica di raccolta dati e analisi. Calorimetri 2,3 Mentre gli altri sono disponibili (in particolare l'ITC 200 con piccoli volumi), qui descriviamo un protocollo generale per la VP-ITC fabbricati da MicroCal (ora parte di GE Healthcare).
1. Preparazione Campioni
- Per preparare la macromolecola e ligando nel buffer, alcune potenziali problematiche devono essere affrontate. Si adatta accurato richiedono concentrazione corretta della macromolecola, la specie che va di solito nella cella campione del ITC, e ligando, specie nella siringa. Perché alcune proteine aggregate alle concentrazioni elevate necessarie per la specie nella siringa per iniezione, il più delle volte la proteina viene caricato nella cella campione. La concentrazione ottimale macromolecola è determinato da "c", il prodotto della affinità previsto del sistema, che può essere stimato con metodi ortogonali prima di utilizzare ITC, e la concentrazione macromolecola totale, dove c = K a * [M]. Valori ottimali del campo c 10-1000, 1 se è possibile ottenere dati precisi per deboli nel legame sistemi in specifiche condizioni sperimentali con c-valori al di sotto del limite inferiore. 4 Così, la concentrazione macromolecola deve essere determinata con questa gamma di valori di c in mente (ad esempio, per un K a di 10 6 M -1, concentrazioni macromolecola da 10 a 1000 mM dovrebbe essere usato). Conoscenza preliminare della affinità di legame del sistema può aiutare a minimizzare la proteina usata per ITC attraverso una migliore progettazione dell'esperimento ITC. La concentrazione del ligando deve essere sufficientemente grande (7-25 volte più concentrato di quello d K per il sito di legame più debole) in modo che la saturazione si verifica entro il primo terzo alla metà della titolazione. Montaggio accurato dei dati richiede anche la saturazione del segnale. Per i sistemi con una maggiore affinità di legame, una concentrazione di ligando minore deve essere usato per evitare la saturazione troppo presto nella titolazione, che darà adatta imprecisi. Una volta che il calore di diluizione del controllo (ad esempio la titolazione del ligando nel buffer) è stato sottratto dal titolazione, l'entalpia di saturazione dovrebbe avvicinarsi allo zero.
- Perché impurità piccola molecola può dare origine a segnali artefatta nelle misure ITC, è meglio, se possibile, che la macromolecola e ligando essere esaustivo dializzati contro buffer. In alternativa, cromatografia su colonna, dissalazione colonne di rotazione, o tampone filtri scambio centrifugo (per esempio, Centricons) può essere utilizzato per modificare il buffer della macromolecola. Se il legante è una piccola molecola, che può essere preparato utilizzando il buffer di dialisi dopo la macromolecola è stato dializzati o con dialisi contro membrane da dialisi con cut-off adatto per piccole molecole (ad esempio 100-500 Da un Spectra / Por Float-A-Lyzer ). Le differenze nella composizione cuscinetto tra il ligando e soluzioni macromolecola può portare ad artefatti segnale dal calore della diluizione delle impurità nei campioni. Dopo la preparazione, controllare che il pH della partita buffer, macromolecola e ligando (± 0,05 unità di pH) come artefatti nel entalpia possono sorgere a causa del buffer effetti protonazione. 5 Assicurarsi di preparare abbastanza di ogni specie. Per esperimenti in triplo e un controllo di diluizione, la quantità di materiale necessario dipende dalla ITC utilizzati. Ma, per la maggior parte degli strumenti ITC che sono circa 2 ml di cellule campione di volume, almeno 6-7 ml di soluzione macromolecola saranno necessari, e possono essere comodamente preparato in 15 ml tubi falco. Per 300 siringhe da iniezione microlitri, 1-2 ml di soluzione devono essere adeguati, e può essere preparato in entrambi i tubi di falco o tubi microcentrifuga.
- Polvere e altre particelle, possono causare artefatti in linea di base del termogramma ITC. E 'imperativo che siano rimossi prima di eseguire l'esperimento. Dopo la preparazione delle soluzioni madre del campione, i campioni devono essere centrifugati in tubi microcentrifuga per cinque minuti a 8000 a 14.000 RPM pellet particelle in soluzione. Rimuovere il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet, e metterlo in un falco / microcentrifuga nuovo tubo.
Se riducenti sono necessarie per mantenere cisteine ridotte, l'uso basse concentrazioni e le scorte fresco di β-mercaptoethanol, TCEP (tris (2-carbossi) fosfina) o ditiotreitolo per ridurre al minimo qualsiasi artefatto dovuto all'ossidazione riducente. Inoltre, la presenza di solventi organici nel buffer (comune per alcuni ligandi piccola molecola che potrebbe essere necessario metanolo o DMSO per essere solubile) può causare artefatti del segnale. Se solventi organici necessari per il ligando, allora la soluzione macromolecola deve contenere anche la stessa concentrazione per evitare qualsiasi segnale derivante dal calore di diluizione del solvente organico. Lievi differenze nella composizione cuscinetto tra il ligando e macromolecola a causa di cosolventi, sali o pH sono possibili durante la preparazione dei campioni. E 'meglio verificare la diluizione del ligando nel buffer del campione o del tampone campione nella macromolecola per assicurare che i segnali di calore derivanti dalle differenze di contenuto del buffer non causano dati derivante esclusivamente dagli artefatti. - Controllare la concentrazione della macromolecola e ligando accuratamente con tecniche adatte al vostro sistema (come ad esempio le misure di assorbanza, HPLC, test colorimetrici, saggi BCA per le proteine, ecc) per registrare il loro concentrazione esatta. Differenze nella concentrazione effettiva e la concentrazione utilizzati per adattare l'isoterma causerà errori nella stechiometria, entalpia e affinità di legame determinati dall'esperimento. E 'comune a Degas i campioni al fine di evitare artefatti del segnale a causa di bolle d'aria o il rilascio di gas disciolti nel corso della titolazione, in particolare a temperature più elevate.
2. Configurazione del test
- Assicurarsi che la cella campione e la siringa per iniezione sono puliti secondo il protocollo del produttore prima di caricare la macromolecola e ligando. Risciacquare la cella del campione due o tre volte con 1,8 ml di acqua distillata usando la siringa Hamilton (fare attenzione con la siringa Hamilton come la canna è facilmente rotto o piegato il ago). Avanti sciacquare la cella campione più volte con 1,8 ml di buffer. Caricare il cellulare del campione con 1,8 ml di soluzione macromolecola, facendo attenzione ad evitare la formazione di bolle.
- Riempire la cella di riferimento con acqua distillata. Per la maggior parte tamponi, acqua distillata va bene da utilizzare come soluzione di riferimento. Tuttavia, per i buffer di forza ionica particolarmente elevate o di osmolalità, è meglio utilizzare il buffer come riferimento.
- Rimuovere le bolle d'aria dalle cellule e del campione con la siringa Hamilton. Delicatamente spostare l'ago della siringa su e giù i lati della cellula bussare eventuali bolle che possono essere alla base della cellula e attaccato al bene alla parte superiore della cella. Rimuovere qualsiasi volume in eccesso dal campione e le cellule di riferimento.
- Attaccare una siringa di plastica alla porta di riempimento della siringa utilizzando un tubo. Sciacquare la siringa con acqua distillata. Seguite da un buffer di risciacquo. Assicurarsi che la siringa è completamente evacuato disegnando l'aria attraverso il sistema. Posizionare l'ago della siringa nella soluzione ligando e disegnare la soluzione legante nella siringa di iniezione fino a quando la siringa è piena. Continuare a disegnare un piccolo volume in eccesso (circa 50 microlitri o più) nella porta e il tubo attaccato. Si chiude subito la porta di riempimento della siringa e staccare la siringa e tubi in plastica. Purge e riempire la siringa d'iniezione due volte per rimuovere eventuali bolle dalla siringa. Rimuovere la siringa dalla soluzione legante e pulire il lato con un kimwipe per rimuovere eventuali cadute, facendo attenzione a non toccare la punta della siringa al kimwipe in quanto ciò potrebbe togliere il volume della siringa. Inoltre, fare attenzione a non urtare o barattolo la siringa in quanto ciò può causare anche perdita di volume dalla punta della siringa. Posizionare la siringa nella cella del campione.
- Impostare i parametri per l'esecuzione del ITC. Per i sistemi di rilegatura con segnali forte calore, un elevato numero di iniezioni a basso volume darà punti più dati per il montaggio (es. 75 iniezioni di 3 ml). Per i sistemi che hanno i segnali deboli di calore, un piccolo numero di iniezioni di grandi volumi sono da preferire (per esempio 33 iniezioni di 8 microlitri). Più comunemente, un minor numero di iniezioni con volumi di iniezione maggiore sono in uso. Si può richiedere diverse titolazioni per ottimizzare le condizioni che sono i migliori per il vostro sistema. E 'importante notare che l'entalpia vincolante può essere esotermica o endotermica, a seconda del sistema in fase di studio. Purtroppo, alcuni sistemi hanno segnali a fuoco basso, rendendo il calore di reazione difficile da determinare. Problemi con tali sistemi possono potenzialmente essere superato aumentando la concentrazione della macromolecola, modificare la temperatura dell'esperimento (a seconda della capacità termica del sistema di rilegatura), e / o alterare il pH o forza ionica del tampone.
- Anche prendere in considerazione la distanza di tempo tra ogni iniezione. E 'imperativo che dopo ogni iniezione di ligando, il sistema è dato il tempo di equilibrare e il segnale di calore ritorna al basale prima dell'iniezione successiva verifica. Per la maggior parte dei sistemi, 04:57 minutes dovrebbe essere adeguato. Il tempo tra le iniezioni devono essere aumentate sistemi in cui l'equilibrio non si verifica entro cinque minuti.
- Perché ci sarà qualche miscelazione tra la macromolecola e soluzioni ligando nella siringa una volta che è inserita nella cella del campione, la prima iniezione darà risultati spuri. E 'meglio usare piccoli volumi (ad esempio 2 microlitri) per i primi uno o due iniezioni (in modo che possano poi essere scartato) e mantenere le iniezioni successive ai valori desiderati.
- Scegliere la temperatura della sperimentazione (con 25 ° C rappresenta la più comune, anche se le temperature tra i 2 ei 80 ° C può essere utilizzato). E 'meglio scegliere una temperatura che corrisponde altri esperimenti (vincolante, cinetica, ecc) eseguite sul sistema ligando-macromolecola. L'ITC può essere impostata per equilibrare ad una temperatura diversa dalla temperatura dell'esperimento. Se l'esperimento sta per essere eseguita ad una temperatura di oltre 10 ° C al riparo dalla temperatura ambiente, quindi è meglio impostare la temperatura di equilibrio per lo strumento entro 5 ° C della temperatura sperimentale. Ciò diminuisce il tempo lo strumento necessario per raggiungere la temperatura di questo esperimento.
La velocità di agitazione della siringa deve anche essere considerato. Agitazione è necessario per un'adeguata miscelazione del legante e macromolecola nel corso della titolazione, ma alcune proteine sono destabilizzate da agitarla rapidamente. Per questi casi, la velocità di agitazione dovrebbe essere fissata a un tasso relativamente basso. Una volta che tutti i parametri sperimentali sono stati istituiti, allora l'esperimento può essere avviato. - Una volta che l'esperimento è finito, l'ITC può essere pulito secondo il protocollo del produttore. La soluzione nella cella del campione, alla fine di questo esperimento può essere mantenuta se ulteriori esperimenti sulla macromolecola-ligando miscela complessa sono volute.
- Ripetere la titolazione almeno una o due volte di più per ottenere dati riproducibili. Eseguire un controllo in cui è titolato ligando nel buffer nella cella del campione per determinare il calore di diluizione per il ligando. Per alcuni sistemi dove c'è cooperativa vincolante, ulteriori informazioni sul processo di associazione può essere ottenuto iniettando il macromolecola nel ligando. Gli orientamenti diversi di iniezione può fornire ulteriori informazioni, che può essere utile per il montaggio globale 6.
3. Analizzando i dati
- Montaggio dei dati può essere facilmente effettuata utilizzando le macro in qualsiasi programma di raccordo dei dati (generalmente fornito dal produttore insieme con lo strumento). Caricare il primo file di dati. Controllare il termogramma prime per eventuali segni di bolle d'aria o altri artefatti nel segnale. Se ci sono artefatti (come i picchi nella linea di base o picchi di quando non c'era l'iniezione a quella data), quindi annotare questi dati come dovrebbero essere rimossi. Quindi, caricare i dati di diluizione controllo ligando, e sottrarre i dati di diluizione ligando dal legame isoterma. A questo punto, rimuovere tutti i punti dati spuri, tra i primi uno o due punti dati della titolazione in cui si verificano artefatti diluizione (vedi punto 7).
- Selezionare il modello di raccordo dei dati (un sito di legame, due / più siti di legame, legame cooperativo, ecc) da utilizzare per adattarsi ai dati. I dati possono essere in forma con ipotesi iniziali dei parametri di montaggio, stechiometria (n), entalpia (ΔH) e affinità di legame (K a). Se la conoscenza preventiva del affinità di legame, o altri parametri, è noto da esperimenti ortogonali, allora questi valori possono essere inseriti. Questo consente di evitare l'adattamento rimanere intrappolati in minimi locali durante il montaggio. Una volta che i dati sono stati in forma per la prima titolazione, ripetere i passaggi 15 e 16 per il resto le isoterme. In alternativa, i dati possono essere in forma a livello globale utilizzando programmi come SEDPHAT 6. SEDPHAT può essere particolarmente utile nel montaggio globale del binario set di dati complessi (cioè molecole A + B) in combinazione con il set di dati complessi ternari (molecole di A + B + C). Ad esempio, nel legame della molecola C per un complesso AB, non è sempre chiaro se ci possa essere alcun segnale dovuto al legame di C alla A o di B ad A (se A non è completamente saturo).
- Per garantire che i dati ITC non sono artefatta, l'affinità di legame e stechiometrie ottenuti da ITC deve essere confrontato con un metodo ortogonale. 7,8 Inoltre, il valore entalpia ITC può essere paragonato al entalpia da un complotto van't Hoff 9. Può anche rivelarsi utile per utilizzare diverse concentrazioni del ligando o macromolecola come valore assoluto del segnale di calore dovrebbe aumentare con l'aumentare della concentrazione di macromolecole. Gli artefatti sono più probabilità di verificarsi se i buffer nella cella e siringa non corrispondono. Un'altra possibilità per i manufatti nasce da campioni impuri.
- Si raccomanda che l'utente inizia con semplici titolazioni binario complessi per i quali ci sono informazioni disponibili sulla precedente K d e stoichiometry. Poi, se ligandi si legano aggiuntivi, l'utente può provare più complicato titolazioni complesso ternario, variando le concentrazioni di ligando, e forse il passaggio della siringa e componenti cellulari. Un confronto tra entalpie per entrambi i percorsi di formazione ternario complesso dovrebbe essere come additivo entalpia è una funzione di stato. 10 Ancora una volta, SEDPHAT 6 è probabile che sia molto utile qui.
4. Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Un esempio rappresentativo di una ben educato titolazione per il legame del cofattore NADPH a E. coli cromosomiche diidrofolato reduttasi (ecDHFR). Pannello (A) mostra il termogramma prime; (B), l'isoterma vincolante dal fit termogramma integrato con il modello di un sito nel software di origine, e (C) l'adattamento del isoterma utilizzando il modello di sito di legame da SEDPHAT lungo con residui in forma. Dal software di origine, utilizzando il modello di sito di legame, n = 1,09 ± 0,02, K d = 0,194 ± 0,001 micron, ΔH = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13,1 ± 0,4 kcal / mol, e DeltaG = - 9,16 ± 0,01 kcal / mol. Adatto dei dati utilizzando Sedphat permettersi una n di 0,94 ± 0,01, una d K di 0,195 ± 0,013 ΔM, un ΔH di -22,5 ± 0,2 kcal / mol, TΔS di -13,39 kcal / mol e DeltaG di -9,15 kcal / mol.
Discussion
ITC è stato ampiamente utilizzato per lo studio delle interazioni macromolecola ligando, 11 con studi sui proteina-ligando, 12 DNA-ligando 13 e RNA-macromolecola 14 studi. ITC può anche essere eseguito con materiali solidi, come nanoparticelle, che formano sospensioni uniforme. 15 Inoltre, i sistemi ternario, dove si ligando è già legato alla macromolecola e un legante secondo è titolato, può essere usato per determinare la termodinamica, ad esempio, il legame del substrato di un enzima-cofattore sistema. 7 studi può essere eseguita anche per molecole con affinità di legame molto alta che normalmente superare il limite di rilevazione del ITC eseguendo saggi di concorrenza vincolante con leganti deboli vincolanti. 16 Informazioni sul debolmente vincolante ligandi possono essere ottenuti anche saggi di concorrenza. 17 Il ruolo dell'acqua nel binding può essere esplorato da ITC, 18 con la dipendenza della entalpia sulla riorganizzazione solvente. 19 Di recente, la termodinamica del cambiamento conformazionale di varianti DNAK sono stati misurati dal legame del ADP e ATP. 20 Proteina-proteina associazione può essere studiato da ITC, ottenendo informazioni sui complessi etero 21 nonché homo-associazione. 22 Effetti della temperatura sulla entalpia vincolante darà la capacità termica della manifestazione vincolanti. 2 Il numero di protoni assorbito o rilasciato dal legame può essere determinata anche da esperimenti eseguiti in buffer con diverse entalpie di ionizzazione. ITC 5 Se studi supplementari sono fatto a valori di pH differenti, allora il pKa del gruppo coinvolti possono potenzialmente essere determinato. 23
Per riassumere, misure accurate della concentrazione della macromolecola e ligando sono indispensabili per un esperimento ITC bene. Concentrazioni del campione devono anche essere in un range corretto per ottenere dati affidabili. Si deve prestare attenzione con il buffer come impurità di piccole molecole e gli squilibri del pH causerà artefatti nel termogramma.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NSF concedere MCB-0817827.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-282 | |
| 15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| 2.5 mL Hamilton syringe | MicroCal | SYN161714 |
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