Summary
Ein allgemeines Protokoll für den Einsatz von isothermen Titrationskalorimetrie, um die Bindung der Thermodynamik für biologische Systeme mit moderaten Bindungsaffinitäten Monitor dargestellt wird.
Abstract
Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist ein nützliches Werkzeug für das Verständnis der gesamten thermodynamischen Bild einer Bindungsreaktion. In biologischen Wissenschaften, sind makromolekulare Interaktionen wesentlich für das Verständnis der Maschinerie der Zelle. Experimentelle Bedingungen, wie Puffer und Temperatur, kann auf den jeweiligen verbindliches System untersucht zugeschnitten werden. Allerdings ist eine sorgfältige Planung notwendig, da bestimmte Ligand und Makromolekül Konzentrationsbereichen notwendig, um nützliche Daten zu erhalten sind. Die Konzentrationen der Makromolekül-und Ligand müssen genau für zuverlässige Ergebnisse ermittelt werden. Pflege muss auch bei der Aufstellung der Proben als Verunreinigungen wesentlich beeinflussen können das Experiment werden. Wenn ITC Experimenten, zusammen mit Kontrollen ordnungsgemäß durchgeführt werden, nützlich Verbindliche Auskünfte, wie die Stöchiometrie, Affinität und Enthalpie, erhalten werden. Durch den Betrieb zusätzliche Experimente unter verschiedenen Puffer-oder Temperaturbedingungen, können detailliertere Informationen über das System gewonnen werden. Ein Protokoll für die grundlegende Einrichtung eines ITC Experiment gegeben ist.
Protocol
Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist eine etablierte Technik, die all die thermodynamischen Parameter (Affinität, Enthalpie und Stöchiometrie) eine bindende Wechselwirkung in einem Experiment bestimmen kann. 1 ITC arbeitet durch Titration ein Reaktionspartner in eine zweite Reaktionspartner unter isothermen Bedingungen. Das gemessene Signal wird die freiwerdende Wärme oder auf Wechselwirkung (Bindung) der beiden Reaktionspartner aufgenommen. Eine Reihe von Injektionen durchgeführt werden und die Wärme Signal gegen Null gehen als der limitierende Reaktionspartner gesättigt. Fitting der Isotherme gibt die thermodynamischen Parameter. Mehrere Bewertungen zur Verfügung, die beschreiben, die Instrumentierung sowie die Mathematik der Datenerhebung und-analyse. 2,3 Während andere Kalorimeter zur Verfügung stehen (vor allem die ITC 200 mit kleinen Volumina), hier beschreiben wir ein allgemeines Protokoll für den VP-ITC hergestellt von MicroCal (jetzt Teil von GE Healthcare).
1. Vorbereitung der Proben
- Um die Makromolekül-und Ligand in Puffer vorzubereiten, müssen einige potenzielle Probleme angegangen werden. Genaue passt erfordern richtige Konzentration des Makromoleküls, die Arten, die in der Regel geht in die Messküvette des ITC und Ligand, die Arten in der Injektionsspritze. Da einige Proteine aggregieren an der hohen Konzentrationen der Spezies in der Injektionsspritze benötigt wird, ist meistens das Protein in der Probe Zelle geladen. Die optimale Makromolekül-Konzentration von "c", das Produkt der vorhergesagten Affinität des Systems, die schätzungsweise mit orthogonalen Methoden vor der Verwendung ITC werden können, und die gesamte Makromolekül-Konzentration, bestimmt, wo c = K a * [M]. Optimale Werte für c-Bereich von 1 bis 10, 1 wenn es möglich ist, genaue Daten für schwach-bindenden Systemen unter bestimmten experimentellen Bedingungen mit c-Werte unterhalb der unteren Grenze erhalten. 4 So muss der Makromolekül-Konzentration mit dieser Serie von bestimmt werden c-Werte im Auge (dh für einen K a 10 6 M -1, Makromolekül-Konzentrationen von 1 bis 10 uM verwendet werden sollte). Vorkenntnisse in der Bindungsaffinität des Systems kann zur Minimierung der Protein für ITC durch eine bessere Gestaltung der ITC Experiment verwendet. Die Konzentration des Liganden sollte groß genug sein (7-25 fach konzentrierter als die K d für die Schwächsten Ligandenbindungsstelle), so dass eine Sättigung eintritt in den ersten Drittel bis die Hälfte der Titration. Genaue Anpassung an die Daten erfordert auch die Sättigung des Signals. Für Systeme mit höheren Bindungsaffinität, sollte eine niedrigere Ligandenkonzentration verwendet, um die Sättigung zu früh in die Titration zu vermeiden, was wird ungenau passt zu geben. Sobald die Hitze der Verdünnung Steuerung (dh die Titration von Ligand in den Puffer) wurde aus der Titration abgezogen, sollte die Enthalpie bei Sättigung gegen Null gehen.
- Weil kleine Molekül Verunreinigungen können zu artifactual Signale in der ITC-Messungen zu geben, ist es am besten, wenn möglich, daß das Makromolekül und Ligand erschöpfend gegen Puffer dialysiert werden. Alternativ können Säulenchromatographie, Entsalzen Spin-Säulen, oder Puffer Austausch zentrifugalen Filter (z. B. Centricons) verwendet, um den Puffer des Makromoleküls zu ändern. Wenn der Ligand ist ein kleines Molekül, kann es unter Verwendung der Dialyse-Puffer nach dem Makromolekül wurde dialysiert wurde oder durch Dialyse gegen Dialysemembranen mit Abschaltungen für kleine Moleküle (dh 100-500 Da für eine Spectra / Por Float-A-Lyzer werden ). Unterschiede in der Zusammensetzung des Puffers zwischen Ligand und Makromolekül-Lösungen kann zu Artefakten aus der Hitze der Verdünnung von Verunreinigungen in den Proben Signal. Nach der Vorbereitung, überprüfen Sie, ob der pH-Wert des Puffers, Makromolekül-und Ligand match (± 0,05 pH-Einheiten) als Artefakte in der Enthalpie kann entstehen durch Protonierung Wirkungen Puffer. 5 Achten Sie darauf, genügend vorzubereiten jeder Spezies. Für Dreifachversuche und einer Verdünnung Kontrolle, wird die Menge des benötigten Materials von der ITC abhängen. Aber für die meisten ITC Instrumente, die ungefähr 2 ml Volumen Probe-Zellen haben, werden mindestens 6-7 ml Makromolekül-Lösung benötigt werden, und kann bequem in 15 ml Falcon-Röhrchen vorbereitet werden. Für 300 ul Injektionsspritzen, sollte 1-2 ml der Lösung ausreichend sein, und kann entweder in Falcon-Röhrchen oder Mikrozentrifugenröhrchen vorbereitet werden.
- Staub und andere Partikel können Artefakte in der Grundlinie der ITC Thermogramm verursachen. Es ist zwingend notwendig, dass sie vor der Ausführung des Experiments entfernt werden. Nach der Vorbereitung der Probe Stammlösungen sollten die Proben in Reaktionsgefäße für 5 Minuten bei 8000 bis 14.000 RPM zu Pellets Partikel in der Lösung zentrifugiert werden. Entfernen Sie den Überstand, darauf achten, daß das Pellet stören, und legen Sie sie in ein neues Falcon / Mikrozentrifugenröhrchen.
Wenn Reduktionsmittel benötigt werden, um reduzierte Cysteine zu halten, verwenden geringen Konzentrationen und frische Vorräte an β-mercaptoethanol, TCEP (Tris (2-Carboxy-) phosphin) oder Dithiothreitol zu minimieren Artefakte durch Reduktionsmittel Oxidation. Auch die Gegenwart von organischen Lösungsmitteln in der Puffer (gemeinsam für einige kleine Moleküle Liganden, Methanol oder DMSO brauchen kann, um löslich sein) verursachen Signal Artefakte. Werden organische Lösungsmittel für den Liganden benötigt werden, dann das Makromolekül Lösung muss auch die gleiche Konzentration auf jedes Signal aus der Hitze der Verdünnung des organischen Lösungsmittels zu vermeiden. Leichte Unterschiede in Zusammensetzung des Puffers zwischen Ligand und Makromolekül durch Cosolventien sind Salze oder pH-Wert während der Vorbereitung der Proben möglich. Am besten ist es, die Verdünnung des Liganden in der Probe Puffer oder der Probenpuffer in das Makromolekül überprüfen, um sicherzustellen, dass die Wärme-Signale auf Grund von Unterschieden in den Buffer-Inhalt verursachen keine Daten, die ausschließlich von Artefakten. - Überprüfen Sie die Konzentrationen der Makromolekül-und Ligand sorgfältig mit Hilfe von Techniken geeignet, um Ihr System (wie Absorptionsmessungen, HPLC, kolorimetrische Assays BCA-Assays für Proteine, etc.), um ihre genauen Konzentrationen erfassen. Unterschiede in der tatsächlichen und der Konzentration verwendet, um die Isotherme passt zu Fehlern in der Stöchiometrie, Enthalpie und Bindungsaffinität aus dem Experiment bestimmt. Es ist üblich, Degas die Proben, um zu signalisieren Artefakte durch Luftblasen oder Freisetzung von gelösten Gasen, die während der Titration, besonders bei höheren Temperaturen zu vermeiden.
2. Einrichtung des Tests
- Sicherstellen, dass die Messzelle und Injektionsspritze nach dem Protokoll des Herstellers sind vor der Beladung des Makromoleküls und Ligand gereinigt. Spülen Sie die Küvette zwei-oder dreimal mit 1,8 ml destilliertem Wasser mit dem Hamilton-Spritze (verwenden Sie Sorgfalt bei der Hamilton-Spritze als das Fass leicht defekt ist oder die Nadel verbogen). Next spülen Sie die Probe Zelle mehrmals mit 1,8 ml Puffer. Laden Sie die Probenzelle mit 1,8 ml des Makromolekül-Lösung, wobei darauf zu Blasenbildung zu vermeiden.
- Füllen Sie die Referenzzelle mit destilliertem Wasser. Für die meisten Puffer, ist destilliertes Wasser in Ordnung, als der Referenz-Lösung verwenden. Doch für Puffer mit besonders hoher Ionenstärke oder der Osmolalität, ist es besser, den Puffer als Referenz verwenden.
- Entfernen Sie Luftblasen aus der Referenz und Probe-Zellen mit dem Hamilton-Spritze. Bewegen Sie die Nadel der Spritze up-and-down die Seiten der Zelle Klopfen keine Blasen, die an der Unterseite der Zelle und an der auch an die Spitze der Zelle kann. Entfernen Sie überschüssiges Volumen der Probe und der Referenz-Zellen.
- Bringen Sie einen Kunststoff-Spritze mit dem Einfüllstutzen der Injektionsspritze mit Schlauch. Spülen Sie die Injektionsspritze mit destilliertem Wasser. Folgen Sie durch einen Puffer zu spülen. Achten Sie darauf, die Injektionsspritze vollständig durch Luft durch das System evakuiert. Stecken Sie die Nadel der Injektionsspritze in die Ligand-Lösung und zeichnen Sie die Ligand-Lösung in die Injektionsspritze, bis die ganze Spritze voll ist. Weiter Zeichnung ein wenig mehr Volumen (ca. 50 ul oder mehr) in den Hafen und die angeschlossenen Schläuche. Unmittelbar in der Nähe der Einfüllöffnung der Spritze und entfernen Sie den Schlauch und Kunststoff-Spritze. Spül-und Nachfüllen der Injektionsspritze zwei weitere Male, um Luftblasen aus der Spritze zu entfernen. Entfernen Sie die Spritze aus der Ligand-Lösung und wischen Sie die Seite mit einem Kimwipe keine Tropfen zu entfernen, darauf achten, daß die Spitze der Spritze auf die Kimwipe berühren, da dies zu Volumen aus der Spritze zu entfernen. Auch darauf achten, nicht zu klopfen oder jar die Spritze, da dies auch den Verlust des Volumens aus der Spritze führen können. Legen Sie die Injektionsspritze in die Probenzelle.
- Stellen Sie die Parameter für den Betrieb der ITC. Für verbindliche Systeme mit starker Hitze-Signale wird eine große Anzahl von geringem Volumen Injektionen verabreichen mehr Datenpunkte für die Montage (zB 75 Injektionen von 3 ul). Für Systeme, die schwache Wärme-Signale haben, sind eine kleine Anzahl von großvolumigen Injektionen vorzuziehen (z. B. 33 Injektionen von 8 ul). Am häufigsten sind weniger Injektionen mit höherer Injektionsvolumina verwendet. Es kann mehrere Titrationen, um die Bedingungen, die am besten für Ihr System zu optimieren. Es ist wichtig zu beachten, dass die Bindungsenthalpie kann entweder exotherm oder endotherm, abhängig von der System untersucht. Leider haben einige Systeme bei schwacher Hitze Signale, so dass die Hitze der Reaktion schwer zu bestimmen. Probleme mit solchen Systemen kann möglicherweise durch eine Erhöhung der Konzentration des Makromoleküls, Änderung der Temperatur des Experiments (abhängig von der Wärmekapazität des verbindlichen Systems), und / oder Veränderung der pH-Wert oder Ionenstärke des Puffers überwunden werden.
- Sehen Sie sich auch der zeitliche Abstand zwischen jeder Injektion. Es ist zwingend erforderlich, dass nach jeder Injektion von Liganden, die Systemzeit zu äquilibrieren gegeben ist und die Wärme-Signal auf den Ausgangswert zurück, bevor die nächste Injektion auftritt. Für die meisten Systeme, drei vor fünf minuten ausreichend sein sollte. Die Zeit zwischen den Injektionen sollte für Systeme, bei denen die Gleichgewichtseinstellung nicht innerhalb von fünf Minuten auftritt erhöht werden.
- Da es eine gewisse Mischung wird zwischen dem Makromolekül-und Ligand-Lösungen in die Injektionsspritze, sobald es in die Probe Zelle eingefügt wird, wird die erste Injektion geben falsche Ergebnisse. Es ist am besten für kleine Volumina (zB 2 ul) für die ersten ein oder zwei Injektionen (so können sie später entsorgt werden) zu verwenden und halten Sie die nachfolgenden Injektionen auf den gewünschten Werten.
- Wählen Sie die Temperatur des Experiments (mit 25 ° C ist die häufigste, aber Temperaturen zwischen 2 und 80 ° C verwendet werden kann). Es ist am besten auf eine Temperatur, die anderen Experimenten (verbindliche, Kinetik, etc.) auf der Ligand-Makromolekül-System durchgeführt Spielen wählen. Die ITC kann so eingerichtet werden, bei einer Temperatur von der Temperatur des Experiments Gleichgewicht zu bringen. Wenn das Experiment werde bei einer Temperatur über 10 ° C entfernt von Raumtemperatur durchgeführt werden, dann ist es am besten, die Equilibrierung Temperatur für das Instrument innerhalb von 5 ° C der experimentellen Temperatur einstellen. Dies verringert die Zeit, das Instrument zu ergreifen, um die Temperatur des Experiments erreicht wird.
Die Rührgeschwindigkeit der Spritze muss auch berücksichtigt werden. Das Rühren ist notwendig für eine ausreichende Durchmischung der Ligand und Makromolekül während der Titration, aber einige Proteine werden durch schnelles Rühren destabilisiert. Für diese Fälle sollte die Rührgeschwindigkeit auf einem relativ niedrigen Rate eingestellt werden. Sobald alle experimentellen Parameter wurden eingerichtet, dann das Experiment gestartet werden kann. - Nachdem das Experiment beendet ist, kann die ITC nach dem Protokoll des Herstellers gereinigt werden. Die Lösung in der Probe Zelle am Ende des Experiments gehalten werden kann, wenn zusätzliche Experimente auf der Makromolekül-Ligand-Komplexe Mischung erwünscht sind.
- Wiederholen Sie die Titration mindestens ein oder zwei weitere Male, um reproduzierbare Daten zu erhalten. Führen Sie einen steuern, wo Liganden in den Puffer in die Messküvette titriert, um die Hitze der Verdünnung für den Liganden zu bestimmen. Bei einigen Systemen, wo es kooperative Bindung, zusätzliche Informationen über die verbindliche Prozess kann durch die Injektion des Makromoleküls in den Liganden gewonnen werden. Die verschiedenen Injektion Orientierungen geben können zusätzliche Informationen, die hilfreich sein können für die globale Anpassung. 6
3. Analyse der Daten
- Fitting der Daten kann einfach durchgeführt werden mit Hilfe von Makros in alle Daten passend Programm (in der Regel vom Hersteller zusammen mit dem Gerät mitgeliefert). Legen Sie die erste Datei. Überprüfen Sie die rohe Thermogramm auf Anzeichen von Luftblasen oder andere Artefakte im Signal. Wenn es irgendwelche Artefakte (wie Dornen in der Baseline oder Spitzen, wenn es keine Injektion zu diesem Zeitpunkt), dann beachten Sie diese Datenpunkte, wie sie sollten entfernt werden. Anschließend laden Sie die Liganden Verdünnung Steuerdaten, und subtrahieren Sie die Liganden Verdünnung Daten aus dem Bindungsisotherme. Zu dieser Zeit, entfernen Sie alle falsche Datenpunkte, darunter die ersten ein oder zwei Datenpunkte der Titration, wo Verdünnung Artefakte auftreten (siehe Schritt 7).
- Wählen Sie die Daten passende Modell (eine Bindungsstelle, zwei / mehrere Bindungsstellen, kooperative Bindung, etc.) verwendet werden, um die Daten angepasst werden. Die Daten können mit anfänglichen Vermutungen der Anpassungsparameter, Stöchiometrie (n), Enthalpie (AH) und Bindungsaffinität zu passen (K a). Wenn vorherige Kenntnis der Bindungsaffinität, oder andere Parameter, von orthogonalen Experimenten bekannt ist, dann werden diese Werte eingegeben werden können. So wird vermieden, die fit Einklemmen in lokalen Minima während der Montage. Sobald die Daten für das erste Titration passen, wiederholen Sie die Schritte 15 und 16 für den Rest der Isothermen. Alternativ können die Daten passen weltweit mit Programmen wie SEDPHAT werden. 6 SEDPHAT kann besonders hilfreich bei der globalen Anpassung von binären komplexen Datensätzen (dh Moleküle, A + B) in Kombination mit ternären Komplexes Datensätze (Moleküle A + B + C). Zum Beispiel bei der Bindung des Moleküls C zu einem AB-Komplex, es ist nicht immer klar, ob es vielleicht irgendein Signal durch Bindung von C nach A oder von B nach A (wenn A nicht vollständig gesättigt) werden.
- Um sicherzustellen, dass die ITC Daten nicht artifactual, sollte die Bindungsaffinität und Stöchiometrien von ITC erhalten mit einem orthogonalen Methode verglichen werden. 7,8 Zusätzlich die ITC Enthalpie Wert auf die Enthalpie von einem van't Hoff Plot verglichen werden kann. 9 Es kann auch hilfreich sein, um unterschiedliche Konzentrationen des Liganden oder Makromolekül als der absolute Wert der Wärme-Signal mit zunehmender Makromolekül-Konzentration erhöhen sollte. Artefakte sind am ehesten entstehen, wenn die Puffer in die Zelle und die Spritze nicht aufeinander abgestimmt sind. Eine weitere Möglichkeit für Artefakte ergibt sich aus verunreinigten Proben.
- Wir empfehlen, dass der Benutzer mit einfachen binären Komplexes Titrationen starten, für die es letzten verfügbaren Informationen über K d und stöchiometry. Dann, wenn zusätzliche Liganden zu binden, kann der Benutzer versuchen komplizierter ternären Komplex Titrationen, die Variation der Liganden-Konzentrationen, und vielleicht Einschalten der Spritze und Zellbestandteile. Ein Vergleich der Enthalpien für beide Wege zu ternären Komplexbildung sollten additiv sein als Enthalpie eine Zustandsfunktion ist. 10 Wieder SEDPHAT 6 wahrscheinlich sehr nützlich sein, hier ist.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Ein repräsentatives Beispiel für ein gut erzogener Titration für die Bindung des Cofaktors NADPH zu E. coli chromosomal Dihydrofolatreduktase (ecDHFR). Panel (A) zeigt die rohe Thermogramm; (B), mit dem Bindungsisotherme aus dem integrierten Thermogramm passen die one-site-Modell in der Origin-Software und (C) den Sitz der Isotherme mit der eine Bindungsstelle Modell aus SEDPHAT entlang Mit Fit Residuen. Von der Origin-Software, mit der einen Seite verbindliche Modell, n = 1,09 ± 0,02, K d = 0,194 ± 0,001 uM, AH = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13,1 ± 0,4 kcal / mol, und DG = - 9,16 ± 0,01 kcal / mol. Passt der Daten mit Hilfe Sedphat leisten einen n von 0,94 ± 0,01, ein K d von 0,195 ± 0,013 Dm, ein AH von -22,5 ± 0,2 kcal / mol, TΔS von -13,39 kcal / mol und ΔG von -9,15 kcal / mol.
Discussion
ITC wurde ausgiebig studieren Ligand-Interaktionen Makromolekül, 11 mit Studien, die Protein-Ligand, 12 DNA-Liganden-13 und RNA-Makromolekül 14 Studien eingesetzt. ITC kann sogar mit festen Materialien, wie Nanopartikel, dass einheitliche Suspensionen Form ausgeführt werden. 15 Weitere, ternäre Systeme, bei denen ein Ligand bereits an das Makromolekül gebunden ist und ein zweiter Ligand titriert, verwendet werden, um die Thermodynamik bestimmt werden, Beispielsweise kann die Bindung des Substrats an ein Enzym-Cofaktor-System. 7 Studien auch für Moleküle mit sehr hohen Bindungsaffinitäten, die normalerweise mehr als die Nachweisgrenze des ITC, indem Wettbewerb Bindungsassays mit schwächeren bindenden Liganden durchgeführt würde. 16 Informationen zu schwach bindende Liganden können auch durch die Konkurrenz-Assays erzielt werden. 17 Die Rolle des Wassers bei der Bindung von ITC, 18 kann zusammen mit der Abhängigkeit der Enthalpie auf Lösungsmittel Reorganisation untersucht werden. 19 Kürzlich wurden die Thermodynamik der Konformationsänderung von DnaK Varianten bei der Bindung von gemessenen ADP und ATP. 20 Protein-Protein-Assoziation von ITC untersucht werden können, wodurch Informationen über hetero-Komplexe 21 sowie auf Homo-Verein. 22 Temperatur Auswirkungen auf die Bindungsenthalpie geben die Wärmekapazität der Bindung Veranstaltung. 2 Die Zahl der Protonen aufgenommen oder freigesetzt bei der Bindung kann auch aus Experimenten in Puffern mit unterschiedlichen Enthalpien der Ionisation durchgeführt bestimmt werden. 5 Wenn zusätzliche ITC-Studien bei verschiedenen pH-Werten sind fertig, dann ist die pKa der Gruppe beteiligt potenziell bestimmt. werden 23
Zusammenfassend sind genaue Messungen der Konzentration des Makromoleküls und Ligand unerlässlich für eine gute ITC Experiment. Probenkonzentrationen müssen auch innerhalb eines geeigneten Bereichs werden, um zuverlässige Daten zu erhalten. Es sollte mit dem Puffer genommen werden, da kleine Moleküle Verunreinigungen und pH Fehlanpassungen werden Artefakte im Thermogramm verursachen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der NSF gewähren MCB-0817827 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-282 | |
| 15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| 2.5 mL Hamilton syringe | MicroCal | SYN161714 |
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