HLA-Ig Basierend Artificial Antigen-präsentierende Zellen für eine effiziente Ex vivo Erweiterung des menschlichen CTL

Summary

Ein neuer DC unabhängige Methode zur Induktion und Expansion von Antigen-spezifischen T-Zellen beschrieben. HLA A2-Ig Basis künstlicher Antigen-präsentierende Zellen (AAPC) sind mit HLA-A2 restringierte Peptide effizient erweitern CTL verschiedener Antigen-Spezifität geladen. Diese Technologie birgt ein großes Potenzial für die CTL-basierte adoptiven Immuntherapie.

Abstract

CTL mit optimaler Effektor-Funktion spielen eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung von Schutz gegen verschiedene intrazelluläre Infektionen und Krebs. Jedoch können Einzelpersonen weisen suppressive Immunsystem Mikroumgebung und im Gegensatz zu aktivierenden CTL, die autologe Antigen-präsentierende Zellen können dazu neigen, tolerize oder anergize Antigen-spezifischen CTL. Als Ergebnis, obwohl noch in der experimentellen Phase, hat CTL-basierte adoptiven Immuntherapie entwickelt, um eine viel versprechende Behandlung für verschiedene Krankheiten wie Krebs und Virusinfektionen werden. In ersten Experimenten ex vivo expandierten CMV (Cytomegalovirus) spezifische CTL sind für die Behandlung von CMV-Infektion bei immunsupprimierten allogenen Knochenmark-transplantierten Patienten eingesetzt. Zwar ist es üblich, lebensbedrohliche CMV-Virämie bei diesen Patienten haben, keiner der Patienten erweitert CTL entwickeln CMV Erkrankung, was bedeutet, das Anti-CMV Immunität von der adoptiv übertragen CTL ¹ hergestellt. Vielversprechende Ergebnisse wurden auch für Melanome beobachtet worden und kann auf andere Arten von Krebs ² verlängert werden.

Zwar gibt es viele Möglichkeiten, um ex vivo zu stimulieren und zu erweitern menschlichen CTL sind, werden aktuelle Ansätze der Kosten und technische Grenzen beschränkt. Zum Beispiel ist der derzeitige Goldstandard für die Verwendung von autologen DC. Dies erfordert jeden Patienten zu einer signifikanten Anzahl der Leukozyten zu spenden und ist auch sehr teuer und aufwändig. Darüber hinaus hat detaillierte In-vitro-Charakterisierung der DC erweitert CTL ergab, dass diese nur suboptimal Effektor-Funktion ³ haben.

Hier präsentieren wir eine hocheffiziente AAPC basiertes System für die ex vivo Expansion von humanen CMV-spezifischen CTL zur adoptiven Immuntherapie (Abbildung 1). Die AAPC wurden durch Kopplung Zelle magnetische Kügelchen mit humanen HLA-A2-Ig-Dimer-und Anti-CD28mAb ^4. Sobald AAPC gemacht sind, können sie mit verschiedenen Peptiden von Interesse geladen werden und bleiben für Monate funktionsfähig. In diesem Bericht wurden AAPC mit einer dominanten Peptid aus CMV, pp65 (NLVPMVATV) geladen. Nach der Kultivierung humaner CD8 ⁺ CTL von einem gesunden Spender mit AAPC für eine Woche, kann CMV-spezifischen CTL dramatisch in die Spezifität erhöht werden bis zu 98% (Abbildung 2) und verstärkt mehr als 10.000-fach. Wenn mehr CMV-spezifische CTL erforderlich sind, kann die weitere Expansion leicht durch repetitive Stimulation mit AAPC erreicht werden. Phänotypische und funktionelle Charakterisierung zeigt diese expandierten Zellen haben ein Effektor-Memory-Phänotyp und machen erhebliche Mengen der beiden TNF und IFN &ggr; (Abbildung 3).

Protocol

1. Making, HLA-A2-Ig Basis AAPC

1. Bereiten Sie sterile Boratpuffer
   1. Lösen Sie Borsäure in Wasser bis 0,1 zu machen. Den pH-Wert auf 7,0.
   2. Filter durch einen 0,22 &mgr; m Sterilfilter und lagern bei 4 ° C.
2. Bereiten Sie sterile Bead Waschpuffer
   1. Nehmen Sie 956ml PBS w / o Magnesium oder Calcium.
   2. Fügen Sie 30ml humanem AB-Serum.
   3. Add EDTA 2 mM Endkonzentration.
   4. Add 0.1gsodium Azid.
   5. Filter durch ein 0,22 um sterile Filter und lagern bei 4 ° C.
3. Nehmen Sie 1 ml Invitrogen M-450 Epoxy Perlen ab Lager, rund 400 Millionen Beads (Perlen können von Zählkammer gezählt werden), und in eine sterile, Schraubverschluss Glasfläschchen.
4. Legen Sie die Flasche gegen eine Dynal Magneten MPC-1, während die Perlen an der Seite des Fläschchens haften, entfernen Sie die Überstände durch Absaugen. Wash Perlen einmal mit 1 ml Boratpuffer.
5. Resuspendieren Perlen in einer Mischung aus 1 ml Boratpuffer und 20 ug HLA-A2-Ig-Dimer und 20 ug anti-human CD28 mAb (Clone 9,3).
6. Protein zu Wulst Konjugation: put der Glasflasche auf Rotator und drehen bei 4 ° C für 24 Stunden.
7. Das Röhrchen wird in MPC-1 Magnet und entfernen Sie alle Boratpuffer.
8. Waschen Sie die Kugeln zweimal mit 1 ml Bead Waschpuffer.
9. Inkubieren Sie die Perlen in 1ml Bead Waschpuffer bei 4 ° zu drehen C für 24 Stunden. Da Bead Waschpuffer enthält humanem AB-Serum, wird es alle Restprotein Bindungsstelle auf die Perlen zu blockieren.
10. Entfernen Sie den Überstand aus Glasflasche, mit 1 ml frisches Bead Waschpuffer zu ersetzen.

2. Qualitätskontrolle von AAPC und Peptid-Beladung, Lagerung

1. Fügen Sie ~ ⁵ × 10 5 Perlen auf 100 &mgr; FACS-Waschpuffer in FACS-Röhrchen und Fleck mit 1μl der Anti-Maus-IgG1-PE (erkennt den Fc-Teil des HLA-A2-Ig) und 1μl der Anti-Maus-IgG2a-FITC (zu erkennen den Fc-Teil des anti-CD28 mAb). Nach der Färbung für 20 Minuten in FACS-Waschpuffer, wieder waschen und lesen Sie das Färbeergebnis sofort Durchflußzytometer (Abbildung 4).
2. Peptide Verladung auf die Perlen: Waschen Sie die Kugeln zweimal in Glasfläschchen mit 1ml sterile PBS. Resuspendieren mit 1 ml sterilem PBS fügen Sie dann 10 &mgr; l von CMV-Peptid (1mg/ml)
3. Zählen Sie die Perlen durch Hämozytometer und Etikett der Flasche mit Datum und Konzentration.
4. AAPC sind bereit für den Einsatz nach mindestens 3 Tage Peptid Inkubation bei 4 ° C, um genügend Zeit für die Bindung des Peptids auf das HLA-A2-Ig-Dimer zu ermöglichen. Die Perlen können bei 4 ° C gelagert werden und bleiben für mindestens 6 Monate funktionsfähig.

3. Menschliche CTL Isolation

1. Sammeln ~ 100ml frischer peripheren Blut von gesunden HLA-A2 positiven Spender in 10 BD Sodium Heparin Vacutainer-Röhrchen. Verwenden Sie eine 21-Gauge-Nadel oder größer, um eine Hämolyse zu vermeiden.
2. Zentrifuge bei 300xg für 10 Minuten bei Raumtemperatur
3. Entfernen Sie vorsichtig die obere Plasmaschicht durch Aspiration. Das Plasma kann als Ergänzung für das Kulturmedium verwendet werden.
4. Ersetzen Sie das gesammelte Plasma mit sterilem PBS und Transfer das Blut in einem sterilen T75 Kulturflasche oder 50ml konische Röhrchen. Mix das Blut mit PBS gut durch Auf-und Abpipettieren.
5. Nach all dem Blut gesammelt werden, bereiten vier weitere 50ml konische Röhrchen und fügen 15ml Ficoll-Paque Plus.
6. Langsam Overlay 30-35ml von Blutzellen auf der Oberseite des Ficoll jeder Röhre. Halten Sie die Schnittstelle zwischen den verschiedenen Ficoll und Blutzellen.
7. Zentrifugation bei 500 xg für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Schalten Sie die Bremse "off" und die Beschleunigung so gering wie möglich eine klare Schnittstelle zwischen den Schichten zu erhalten.
8. Mit einem seriological Pipette vorsichtig absaugen PBMC-Schicht und sammeln Sie die PBMC in ein frisches 50ml konischen Rohr. Wenn alle PBMC geerntet add 30 ml PBS und Spin bei 400xg für 10 min. Überstand verwerfen und waschen noch einmal mit 30 ml PBS, um alle verbleibenden Ficoll entfernen.
9. Fahren Sie mit CD8 ⁺ T-Zell-Isolierung durch Miltenyi menschlichen CD8 ⁺ T-Zell-Isolation Kit nach Protokoll des Herstellers. Dieses Kit sehr bereichert für CD8 ^+-Zellen (in der Regel> 95%) durch Minderung der CD8 ^- Zellen.
10. Zählen Sie die CD8 ⁺ T-Zellen. Die erwartete Reinheit sollte größer sein als 95%. Zu diesem Einsatz 2x10 ⁵ Zellen bestätigen und führen Sie eine CD4/3/8 FACS-Analyse. Die restlichen CTL kann entweder sofort für Antigen-spezifische AAPC Stimulation oder sie können für die zukünftige Verwendung eingefroren werden.

4. In vitro AAPC Basis Kultursystem

1. Bereiten Sie Kulturmediums
   1. Für TF (T-Zell-Wachstumsfaktor, im Labor ⁴ hergestellt) 2X Kulturmedium: komplettem RPMI-Medium plus 5% Spender autologem Plasma und 8% T-Zell-Wachstumsfaktor.
2. Resuspendieren 1 Million CTL in 8ml von TF 2X Kultur-Medium plus 8ml von kompletten RPMI-Medium, fügen Sie 1 × 10 ⁶ AAPC, gut mischen.
3. Verwenden Sie ein Multi-Channel-Pipette auf den Teller Zellen auf 96 well U unten Zellkulturplatten. (160 ul pro Well)
4. Kultur-Zellen in 37 ° C, 5% CO ₂ incubater für 7 Tage. Feed the Zellen an Tag 4 mit 80 ul / well TF 2X Medium.
5. Die Zellen sind bereit, am Tag 7 geerntet werden. Nach der Ernte statt die Zellen vor dem Magneten und entfernen Sie die alte AAPC.
6. Antigen-Spezifität kann durch Tetramer-Färbung nach dem Protokoll des Herstellers bestimmt werden. Phänotyp Färbung und intrazelluläre Zytokin-Färbung sind nach unserer vorherigen Studie ³ durchgeführt.
7. Geernteten Zellen können mit AAPC replattiert wieder unter den gleichen Bedingungen. Zellzahl und Antigen-Spezifität wird erwartet, dass nach wiederholter Stimulation erhöhen.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Ein Beispiel für AAPC nach HLA A2-Ig und anti-CD28-Konjugation ist in Abbildung 4 dargestellt. Erfolgreiche Proteinkonjugation ist offensichtlich durch eine deutliche Verschiebung der entsprechenden Antikörper-Färbung. Während die Häufigkeit von CMV-spezifischen CTL im peripheren Blut ist in der Regel 0,5-1%, nach einer Woche von AAPC-vermittelte Stimulation kann die Spezifität zu erreichen 55 bis 93% (Abb. 2 und 3). Die Expansion von Antigen-spezifischen CTL kann sehr variabel zwischen verschiedenen Gebern, aber die Ergebnisse sind reproduzierbar innerhalb des gleichen Spenders. Durch Extrapolation kann der Ausbau der CMV spezifische Zellen Tausende von fache verglichen mit Vorstufe Ebenen direkt ex vivo (Daten nicht gezeigt). Intrazelluläre Zytokin-Färbung (Abbildung 3) zeigt, dass diese erweiterte CTL polyfunktionellen, anstatt erschöpft sind, nach längerer Zellkultur und erhebliche Verbreitung.

Abbildung 1. Representative Flussdiagramm AAPC basierte ex vivo Expansion der menschlichen CTL zur adoptiven Immuntherapie bei allogener HSCT

Abbildung 2. Representative Tetramer Färbung durch CMV-spezifischen CTL durch AAPC nach einer Woche der Kultur erzeugt

Abbildung 3. Representative intrazelluläre Zytokin-Färbung aufgrund der CMV-spezifischen CTL durch AAPC generiert (CMV Spezifität betrug 61%)

Abbildung 4. Representative Färbeergebnis der M-450 Epoxy Perlen nach Proteinkonjugation mit Anti-Maus-IgG1-PE und anti-Maus IgG2-FITC gefärbt

Discussion

Die AAPC System, das wir hier beschreiben, ist ein effizientes System für die ex vivo Expansion der menschlichen CTL gegen eine Vielzahl von Antigenen. Besondere Vorsicht ist im Hinblick auf die Qualität des Proteins Konjugation und die gleichmäßige Verteilung der AAPC und CTL in der 96-Well-Platte Kultur genommen werden. Mit diesem Ansatz konnten wir CTL erweitern seit mehr als 8 Wochen, in denen wir von Antigen-spezifischen CTL erweitert bis zu einer Million fach ^4. Es gab verschiedene künstliche APC-Systeme, die Zell-Linien oder andere azellulären Plattformen ⁵ worden, aber nach den veröffentlichten Daten jedes System hat sein einzigartiges Profil in Bezug auf Ausbau und Spezifität Unterstützung verschiedener Anwendungen. Wichtig ist, da die Qualität der CTL ist ebenso wichtig wie Quantität, sind die Polyfunktionalität der CMV-spezifischen CTL durch unser System generiert erwartet überlegene antivirale Wirksamkeit zu verleihen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vacutainer tube (contains heparin)	BD Biosciences	367874
Human CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-094-156
Dynabeads M-450 Epoxy	Invitrogen	140.11
Dynal MPC-1 Magnet	Invitrogen	120-01D
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
RPMI medium 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
HLA-A2-Ig dimer X	BD Biosciences	551263
iTAgMHC tetramer (HLA-A2-CMV)-PE	Beckman Coulter Inc.	T20099
Falcon clear 96-well Microtest plate	BD Biosciences	353077
Rat anti-mouse IgG2a-FITC	BD Biosciences	553390
Goat anti-mouse IgG1-PE	Invitrogen	P21129
Human serum type AB	Atlanta Biologicals	S40110
Mouse anti-human CD8a-FITC	Sigma-Aldrich	F0772
Mouse anti-human CD8a-APC	BD Biosciences	340684
Mouse anti-human IFNγ-FITC	BD Biosciences	340449
Mouse anti-human TNFα-PE	BD Biosciences	340512