효율에 대한 HLA - IG 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내 확장

Summary

유도 및 항원에 특정한 T 세포의 확장을위한 새로운 DC 독립적인 방법을 설명합니다. HLA A2 - IG 기반의 인공 항원 제시 세포 (aAPC)을 효율적으로 다양한 항원 특이성의 CTL 확장 HLA - A2 제한 펩티드와 함께로드됩니다. 이 기술은 CTL 기반 입양 immunotherapy에 대한 잠재력을 보유하고 있습니다.

Abstract

최적의 효과기 기능 CTL은 다양한 세포 내 감염 및 암에 대한 보호를 중재에 중요한 역할을 재생합니다. 그러나, 개인은 진압 면역 microenvironment을 전시 수 있으며, 활성화 CTL과는 달리 그들의 autologous 항원 제시 세포 tolerize하는 경향이 있거나 특정 항원 CTL을 anergize. 그 결과, 아직 실험 단계에 있지만, CTL 기반 입양 immunotherapy는 암 및 바이러스 감염 등 다양한 질환에 대한 유망한 치료되기 발전했습니다. 초기 실험에서 전 생체내 확대 CMV (사이토 메갈로 바이러스) 특정 CTL은 immunocompromised allogeneic 골수 이식 환자에서 CMV 감염의 치료에 사용되었습니다. 그것이 환자의 생명을 위협하는 CMV viremia의를하는 것이 일반적입니다받을 환자의 없음 CTL은 안티 CMV 내성이 adoptively 전송 CTL ¹ 설립 뜻, CMV와 관련된 질병을 개발 확대했습니다. 있지만 유망 결과는 흑색증에 대한 관찰되었으며 ^암이 다른 종류의 연장 수 있습니다.

인간의 CTL을 자극하고 확장 예 생체내 여러 가지가 있지만, 현재 방법은 비용과 기술적 한계에 의해 제한됩니다. 예를 들어, 현재의 금 본위 제도는 autologous DC의 사용에 따라 달라집니다. 이것은 각각의 환자가 leukocytes의 상당수를 기부 필요하며 비용도 아주 많이하고 힘드는입니다. 또한, DC 확장 CTL의 체외 특성화에 설명된이 단지 suboptimal 효과기 기능 ^3했다고 밝혔다.

우리가 입양 immunotherapy (그림 1) 인간 CMV CTL의 구체적인 예 생체내 확장을위한 고효율 aAPC 기반 시스템을 제시한다. aAPC 인간의 HLA - A2 - IG 이합체 및 안티 CD28mAb ⁴ 셀 크기의 자석 구슬을 결합하여 만들어졌다. aAPC가 만들어진 후에는, 그들은 관심의 다양한 펩티드와 함께로드하고, 몇 달 동안 기능 유지하실 수 있습니다. 이 보고서에서는 aAPC는 CMV, pp65 (NLVPMVATV)에서 지배적인 펩타이드와 함께로드되었습니다. 일주일 동안 aAPC있는 건강한 기증자로부터 인간의 CD8 ⁺ CTL 투석을 culturing 후 CMV CTL은 특정 98% (그림 2) 특이성에 극적으로 증가하고 10,000 명이 넘는 배 증폭하실 수 있습니다. 더 CMV 특정 CTL이 필요한 경우, 추가 확장이 쉽게 aAPC과 반복적인 자극에 의​​해 얻을 수 있습니다. Phenotypic 및 기능 특성이 확장 세포 효과기 메모리 표현형을 가지고 있고 (그림 3) TNFα와 IFNγ 모두 상당한 금액을 보여줍니다.

Protocol

1. 만들기, HLA - A2 - IG 기반 aAPC

1. 무균 borate 버퍼 준비
   1. 0.1M를 만들기 위해 물에 붕산을 디졸브. 7.0 산도를 조정합니다.
   2. 4 0.22μm 멸균 필터와 매장을 통해 필터 ° C.
2. 무균 비드 와시 버퍼 준비
   1. 956ml PBS w / O 마그네슘 또는 칼슘을 가져가라.
   2. 30ml 인간 AB 혈청을 추가합니다.
   3. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 2mM 최종 농도를 추가합니다.
   4. 0.1gsodium azide를 추가합니다.
   5. 4 0.22 μm의 살균 필터와 매장을 통해 필터 ° C.
3. , 주식에서 약 400,000,000 구슬을 (비즈는 hemocytometer로 계산 가능) Invitrogen M - 450 에폭시 비즈의 1ml을 가지고, 살균, 스크류 최고 유리관에 넣어.
4. 비즈가 유리병의 측면을 준수하면서, Dynal 자석 MPC - 1에 대한 병을 넣어, 열망하여 뜨는을 제거하십시오. borate 버퍼의 1ml로 한 번 구슬을 씻으십시오.
5. 1ml borate 버퍼와 HLA - A2 - IG 이합체 및 안티 인간 CD28 mAb (클론 9.3) 20 μg 20 μg의 혼합물에 Resuspend 구슬.
6. 비드 활용하는 단백질 : 회전에 유리관을 넣고 4 회전 ° C를 24 시간 동안.
7. MPC - 1 자석에 튜브를 삽입하고 모든 borate 버퍼를 제거합니다.
8. 1ml 비드 와시 버퍼와 함께 두 번 구슬을 씻으십시오.
9. 1ml 비드 와시 버퍼에 비즈를 품어, 4 회전 ° C를 24 시간 동안. 비드 와시 버퍼 인간 AB 혈청가 포함되어 있기 때문에, 그것은 구슬의 모든 잔류 단백질 바인딩 사이트를 차단합니다.
10. 유리관에서 뜨는 제거 1ml 신선한 비드 와시 버퍼로 바꿉니다.

2. aAPC 및 펩티드 로딩, 저장 품질 관리

1. 외과 튜브의 버퍼를 세탁 100μl 외과에 ~ 5 × 10 ⁵ 구슬을 추가하고, 안티 - 마우스 IgG1 - PE의 1μl (HLA - A2 - IG의 FC 부분을 인식) 및 안티 마우스 IgG2a - FITC의 1μl (인식과 얼룩 안티 CD28 mAb의 FC 부분). 버퍼를 세척 외과에 20 분 얼룩 후, 흐름 cytometer (그림 4)에 의해 즉시 얼룩 결과를 다시 씻고 읽어보십시오.
2. 비즈에 펩타이드 로딩 : 1ml 멸균 PBS로 유리관에 두 구슬을 씻으십시오. 1ml 멸균 PBS로 Resuspend 다음 CMV 펩타이드 (1mg/ml)의 10μl 추가
3. hemocytometer로 비즈를 카운트하고, 날짜와 농도로 병을 라벨.
4. aAPC는 HLA - A2 - IG 이합체에 펩티드 결합의 충분한 시간을 허용하는 4 최소 3 일 펩타이드 부화 ° C, 후 사용할 준비가되어 있습니다. 구슬이 4 저장할 수 있습니다 ° C와 적어도 6 달 동안 기능 남아있다.

3. 인간 CTL 절연

1. 10 BD 나트륨 헤파린의 Vacutainer 튜브로 건강한 HLA - A2 긍정적인 기증자 신선한 주변의 피 ~ 100ml를 수집합니다. 21 게이지 바늘 또는 용혈을 방지하기 위해 대형을 사용합니다.
2. 실온에서 10 분 300xg에서 원심 분리기
3. 조심스럽게 흡인하여 최고 플라즈마 레이어를 제거합니다. 플라즈마는 문화 매체에 대한 보충으로 사용할 수 있습니다.
4. 멸균 PBS로 수집 플라즈마를 교체하고 살균 T75 문화 플라스크 또는 50ml 원뿔 튜브에 혈액을 전송합니다. 물론 최대 pipetting 아래로 PBS로 피를 섞는다.
5. 일단 모든 혈액 수집, 4 개의 추가 50ml 원뿔 튜브를 준비하고 Ficoll - Paque 플러스의 15ml를 추가합니다.
6. 천천히 오버레이 각 튜브의 Ficoll 위에 혈액 세포의 30 35ml. Ficoll과 혈액 세포 사이의 인터페이스는 별도.
7. 실온에서 20 분 500xg에서 원심 분리기. 브레이크 "OFF"와 레이어 사이에 명확한 인터페이스를 유지하기 위해 가능한 한 낮은 가속을 켭니다.
8. seriological 피펫을 사용하여 조심스럽게 PBMC 층을 기음과 신선한 50ml 원뿔 관에 PBMC를 수집합니다. 모든 PBMC 10 분 400xg에서 PBS와 스핀의 30ml 추가 수확하는 경우. 뜨는을 취소하고 모든 잔류 Ficoll을 제거 30ml PBS로 한 번 더 씻는다.
9. Miltenyi 인간의 CD8 ⁺ 제조 업체의 프로토콜에 따라 T 세포 격리 키트를 사용하여 CD8 ⁺ T 세포 격리로 진행합니다. 세포 ^-이 키트는 매우 (보통> 95%) CD8을 파괴하여 CD8 ⁺ 세포에 대한 풍요롭게.
10. CD8 ⁺ T 세포를 계산합니다. 예상 순도는 95 %보다 커야한다. 이 사용 2x10 ⁵ 세포를 확인하고 CD4/3/8 외과 분석을 수행합니다. 나머지 CTL은 어느 항원 특정 aAPC 자극에 바로 사용할 수있는 또는 그들은 나중에 사용하기 위해 냉동 수 있습니다.

4. 체외 aAPC 기반의 문화 시스템에서

1. 문화 매체 준비
   1. TF (국가 실험실 ⁴ 만들어진 T 세포 성장 인자) 2X 문화 매체 : 전체 RPMI 미디어 플러스 플라즈마 및 8% T 세포 성장 인자 autologous 5 % 기증자.
2. 전체 RPMI 매체의 TF 2X 문화 매체 플러스 8ml의 8ml에 Resuspend 1,000,000 CTL은 추가 1 × 10 ⁶ aAPC은 잘 섞는다.
3. 물론 96 U 바닥 조직 배양 플레이트에 플레이트 세포에 멀티 채널 pipetter을 사용합니다. (사람마다 물론 160 μl)
4. 37 문화 세포 ° C, 7 일 동안 5 % CO ₂ incubater. 80 μl / 잘 TF 2X 매체와 일 4 세포를 공급.
5. 세포는 하루에 7 수확 될 준비가 된 것입니다. 수확 후, 자석에 대한 세포를 배치하고 기존 aAPC를 제거합니다.
6. 항원 특이성은 제조 업체의 프로토콜에 따라 tetramer의 얼룩에 의해 결정하실 수 있습니다. 표현형의 얼룩 및 세포내 시토킨 얼룩은 우리의 이전 연구 ^3에 따라 수행됩니다.
7. 수확 세포는 동일한 조건에서 다시 aAPC와 replated 수 있습니다. 휴대폰 번호 및 항원 특이성은 반복 자극 후 증가 예정입니다.

5. 대표 결과 :

HLA A2 - IG 및 안티 CD28 활용 이후 aAPC의 예제는 그림 4에 표시됩니다. 성공적인 단백질 결합에 해당하는 항체 얼룩의 명확한 변화가 분명하다. 주변 혈액에서 CMV 특정 CTL의 빈도가 aAPC - 중재 자극의 단일 주 후, 일반적으로 0.5-1 %이지만, 특이성은 55 도달할 수 - 93% (그림 2 및 3). 항원 특정 CTL의 확장은 다른 기증자 사이에 가변 수 있지만 결과가 동일한 기증자 내에서 재현할 수 있습니다. 추정함으로써, CMV 특정 세포의 확장 전구체 수준을 직접 예 생체내 (데이터가 표시되지 않음)에 비해 배 수천 수 있습니다. 세포내 시토킨 얼룩 (그림 3) 이러한 확장 CTL은 polyfunctional보다는 지친 있으며, 연장 세포 배양과 상당한 확산 후. 것을 보여줍니다

그림 1. allogeneic HSCT의 입양 immunotherapy에 대한 인간의 CTL의 aAPC 기반 전직의 생체내 확장의 대표 플로우 차트

문화 일주일 뒤에 aAPC에 의해 생성된 특정 CMV CTL의 그림 2. 대표 tetramer의 염색법 결과

그림 3. aAPC에 의해 생성된 특정 CMV CTL 대표 세포 시토킨 얼룩 결과 (CMV의 특이성 61 %입니다)

그림 4. M - 450 에폭시 비즈 대표 얼룩 결과 반 마우스 IgG1 - PE 및 안티 마우스 IgG2 - FITC 물들일 단백질 활용 이후

Discussion

우리가 여기서 설명 aAPC 시스템은 항원의 다양한 인간에 대한 CTL의 전직 생체내 확장을위한 효율적인 시스템입니다. 특별한주의가 96 - 웰 플레이트 문화 단백질 결합의 품질과 aAPC과 CTL의 균등과 관련하여 이동해야합니다. 우리는 백만 배 ⁴ 항원 특정 CTL을 확장하는 동안, 이상 8 주 CTL을 확대할 수있다이 방법을 사용합니다. 셀 라인 또는 기타 acellular 플랫폼 ⁵ 활용한 다양한 인공 APC 시스템이되었습니다 있지만, 모든 시스템 확장 및 특이성에 대해서는 서로 다른 애플 리케이션을 지원과 함께 독특한 프로필을 가진 게시된 데이터에 따르면. CTL의 품질 수량만큼이나 중요되기 때문에 중요한 것은, 우리의 시스템에서 발생하는 CMV 특정 CTL의 polyfunctionality이 우수한 안티 바이러스 효율성을 부여 것으로 예상된다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vacutainer tube (contains heparin)	BD Biosciences	367874
Human CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-094-156
Dynabeads M-450 Epoxy	Invitrogen	140.11
Dynal MPC-1 Magnet	Invitrogen	120-01D
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
RPMI medium 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
HLA-A2-Ig dimer X	BD Biosciences	551263
iTAgMHC tetramer (HLA-A2-CMV)-PE	Beckman Coulter Inc.	T20099
Falcon clear 96-well Microtest plate	BD Biosciences	353077
Rat anti-mouse IgG2a-FITC	BD Biosciences	553390
Goat anti-mouse IgG1-PE	Invitrogen	P21129
Human serum type AB	Atlanta Biologicals	S40110
Mouse anti-human CD8a-FITC	Sigma-Aldrich	F0772
Mouse anti-human CD8a-APC	BD Biosciences	340684
Mouse anti-human IFNγ-FITC	BD Biosciences	340449
Mouse anti-human TNFα-PE	BD Biosciences	340512