एचएलए पुलिस महानिरीक्षक के आधार पर कुशल के लिए कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं पूर्व vivo मानव सीटीएल का विस्तार

Summary

प्रेरण और प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के विस्तार के लिए एक नया डीसी स्वतंत्र विधि वर्णित है. एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक आधारित कृत्रिम एंटीजन पेश कोशिकाओं (aAPC) एचएलए-A2 प्रतिबंधित करने के लिए कुशलतापूर्वक विविध प्रतिजन विशिष्टता के सीटीएल विस्तार पेप्टाइड्स के साथ भरी हुई हैं. इस तकनीक सीटीएल आधारित दत्तक immunotherapy के लिए महान क्षमता रखती है.

Protocol

1. बनाना, एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक आधारित aAPC

1. बाँझ borate बफर तैयार
   1. पानी में बोरिक एसिड भंग 0.1M बनाने के लिए. 7.0 पीएच को समायोजित करें.
   2. 4 में एक 0.22μm बाँझ फिल्टर और दुकान के माध्यम से फ़िल्टर डिग्री सेल्सियस
2. बाँझ मनका धो बफर तैयार
   1. 956ml पीबीएस मैग्नीशियम w / ओ या कैल्शियम ले लो.
   2. 30ml मानव अटल बिहारी सीरम जोड़ें.
   3. EDTA 2mm अंतिम एकाग्रता जोड़ें.
   4. 0.1gsodium azide जोड़ें.
   5. 4 में 0.22 सुक्ष्ममापी बाँझ फिल्टर और दुकान के माध्यम से फ़िल्टर डिग्री सेल्सियस
3. Invitrogen M-450 Epoxy मोती के स्टॉक से 1ml लो, लगभग 400 मिलियन मोती (मोती hemocytometer द्वारा गिना जा सकता है है), और एक बाँझ, पेंच शीर्ष कांच की शीशी में डाल दिया.
4. एक Dynal MPC-1 चुंबक के खिलाफ शीशी रखो, जबकि मोती शीशी की तरफ से पालन करने के लिए, आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला हटा दें. Borate बफर के 1ml के साथ मोती एक बार धो.
5. 1ml borate बफर और एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक डिमर और मानव विरोधी CD28 MAB (9.3 क्लोन) के 20 μg के 20 μg का एक मिश्रण में Resuspend मोती.
6. मनका संयुग्मन प्रोटीन: अंग को घुमानेवाली पेशी पर कांच की शीशी में डाल दिया और 4 में बारी बारी से ° 24 घंटे के लिए सी.
7. MPC-1 चुंबक में ट्यूब प्लेस और सभी borate बफर हटायें.
8. 1ml मनका धो बफर के साथ मोती दो बार धो.
9. 1ml मनका धो बफर में मोती सेते हैं, 4 पर बारी बारी ° C 24 घंटे के लिए. क्योंकि मनका धो बफर मानव अटल बिहारी सीरम शामिल हैं, यह मनकों पर सभी अवशिष्ट प्रोटीन बंधनकारी साइट रोकेंगे.
10. कांच की शीशी से सतह पर तैरनेवाला निकालें, 1ml ताजा मनका धो बफर के साथ की जगह.

2. AAPC और पेप्टाइड लोड हो रहा है, भंडारण की गुणवत्ता नियंत्रण

1. 100μl FACS ट्यूबों में बफर धोने FACS के लिए ~ 5 10 ^× 5 मोती जोड़ें, और (एचएलए-A2 - पुलिस महानिरीक्षक के एफसी भाग पहचान) IgG1 पीई विरोधी माउस 1μl और IgG2a FITC विरोधी माउस के 1μl (पहचान के साथ दाग MAB विरोधी CD28 के एफसी भाग). बफर धोने FACS में 20 मिनट के लिए धुंधला हो जाना करने के बाद, फिर से धो और प्रवाह cytometer (चित्रा 4) के द्वारा तुरंत पढ़ा धुंधला परिणाम.
2. मोती पर पेप्टाइड लोड हो रहा है: मोती 1ml बाँझ पीबीएस के साथ कांच की शीशी में दो बार धोने. 1ml बाँझ पीबीएस साथ Resuspend तो सीएमवी पेप्टाइड (1mg/ml) के 10μl जोड़ने
3. Hemocytometer द्वारा मोतियों की गणना, और दिनांक और एकाग्रता के साथ शीशी लेबल.
4. aAPC 4 में कम से कम 3 दिनों पेप्टाइड ऊष्मायन डिग्री सेल्सियस, के बाद उपयोग के लिए तैयार हैं एचएलए-A2 - पुलिस महानिरीक्षक डिमर पर पेप्टाइड बंधन के लिए पर्याप्त समय की अनुमति. मोती 4 में संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस और कम से कम 6 महीने के लिए कार्यात्मक रहते हैं.

3. मानव सीटीएल अलगाव

1. स्वस्थ एचएलए-A2 सकारात्मक दाता से 10 बी.डी. सोडियम हेपरिन Vacutainer ट्यूबों में ~ 100ml ताजा परिधीय रक्त की लीजिए. एक 21 गेज सुई या बड़ा hemolysis को रोकने का उपयोग करें.
2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300xg पर अपकेंद्रित्र
3. ध्यान से आकांक्षा द्वारा शीर्ष प्लाज्मा परत को हटा दें. प्लाज्मा मध्यम संस्कृति के लिए पूरक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
4. बाँझ पीबीएस के साथ एकत्र प्लाज्मा बदलें और एक बाँझ T75 संस्कृति फ्लास्क या 50ml शंक्वाकार ट्यूब में रक्त हस्तांतरण. पीबीएस के साथ अच्छी तरह से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा रक्त मिक्स.
5. एक बार जब सभी रक्त एकत्र किया जाता है, चार अतिरिक्त 50ml शंक्वाकार ट्यूबों तैयार करने और Ficoll Paque प्लस के 15ml जोड़ें.
6. धीरे धीरे रक्त कोशिकाओं के प्रत्येक ट्यूब के Ficoll के शीर्ष पर 30-35ml उपरिशायी. इंटरफ़ेस Ficoll और रक्त कोशिकाओं के बीच अलग रखें.
7. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 500xg अपकेंद्रित्र. ब्रेक "बंद" और के रूप में संभव के रूप में कम करने के लिए परतों के बीच एक स्पष्ट अंतरफलक को बनाए रखने त्वरण चालू.
8. एक seriological विंदुक का प्रयोग, ध्यान से PBMC परत aspirate और एक ताजा 50ml शंक्वाकार ट्यूब में PBMC इकट्ठा. जब सभी PBMC harvested रहे हैं 400xg में पीबीएस और स्पिन के 30ml 10 मिनट के लिए जोड़ें. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 30ml पीबीएस के साथ एक बार धोने के लिए सभी अवशिष्ट Ficoll हटायें.
9. Miltenyi मानव CD8 ⁺ टी सेल अलगाव निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार किट का उपयोग करके CD8 ⁺ टी सेल अलगाव के लिए आगे बढ़ें. कोशिकाओं ^- इस किट CD8 ⁺ कोशिकाओं (> 95% आमतौर पर) CD8 घट के लिए अत्यधिक enriches.
10. CD8 ⁺ टी कोशिकाओं की गणना. उम्मीद की शुद्धता 95% से अधिक होना चाहिए. इस का उपयोग 2x10 ⁵ कोशिकाओं की पुष्टि करें और एक CD4/3/8 FACS विश्लेषण प्रदर्शन. प्रतिजन विशेष aAPC उत्तेजना के लिए शेष सीटीएल या तो किया जा सकता है सही दूर किया या वे भविष्य में उपयोग के लिए जमे हुए किया जा सकता है.

4. इन विट्रो aAPC आधारित संस्कृति प्रणाली में

1. संस्कृति के माध्यम तैयार
   1. TF के लिए (टी सेल वृद्धि कारक है, प्रयोगशाला ^में 4 बनाया) 2X मध्यम संस्कृति: पूरा RPMI मध्यम से अधिक 5% दाता प्लाज्मा और 8% टी सेल वृद्धि कारक ऑटोलॉगस .
2. Resuspend TF 2X संस्कृति प्लस पूरा RPMI मध्यम के माध्यम 8ml 8ml में 1 लाख सीटीएल, 1 जोड़ × 10 ⁶ aAPC, मिश्रण अच्छी तरह से.
3. थाली कोशिकाओं के लिए 96 अच्छी तरह से यू नीचे ऊतक संस्कृति प्लेटों पर एक मल्टी चैनल pipetter का प्रयोग करें. (160 प्रति अच्छी तरह से μl)
4. 37 में संस्कृति कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस, 7 दिनों के लिए 5% _सीओ 2 incubater . 4 दिन 80 μl / अच्छी तरह से TF 2X मध्यम के साथ कोशिकाओं का फ़ीड.
5. कक्ष के लिए 7 दिन काटा जा करने के लिए तैयार हैं. फसल के बाद, चुंबक के खिलाफ कोशिकाओं जगह और पुराने aAPC निकालें.
6. एंटीजन विशिष्टता निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार tetramer धुंधला द्वारा निर्धारित किया जा सकता है है. Phenotype धुंधला हो जाना और intracellular साइटोकाइन धुंधला हो जाना हमारे पिछले अध्ययन ³ के अनुसार प्रदर्शन कर रहे हैं.
7. काटा कोशिकाओं aAPC के साथ replated किया जा सकता है है है फिर एक ही परिस्थितियों में. सेल नंबर और प्रतिजन विशिष्टता दोहराया उत्तेजना के बाद वृद्धि की उम्मीद है.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

A2 - पुलिस महानिरीक्षक एचएलए और विरोधी CD28 संयुग्मन बाद aAPC का एक उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है. सफल प्रोटीन संयुग्मन इसी एंटीबॉडी धुंधला के एक स्पष्ट बदलाव से स्पष्ट है. जबकि सीएमवी परिधीय रक्त में विशिष्ट सीटीएल की आवृत्ति आमतौर पर 0.5-1% aAPC की मध्यस्थता उत्तेजना के एक सप्ताह के बाद,, विशिष्टता 55 तक पहुँच सकते हैं - 93% (चित्रा 2 और 3). विशिष्ट प्रतिजन सीटीएल के विस्तार बहुत अलग दाताओं के बीच चर हो सकते हैं, लेकिन परिणाम एक ही दाता के भीतर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं. एक्सट्रपलेशन, सीएमवी विशिष्ट कक्षों के विस्तार के हजारों गुना अग्रदूत सीधे पूर्व vivo (नहीं दिखाया डेटा है) के स्तर के साथ तुलना की जा सकती . Intracellular साइटोकाइन धुंधला (चित्रा 3) से पता चलता है कि इन विस्तार सीटीएल polyfunctional, बजाय थक रहे हैं, लंबे समय तक सेल संस्कृति और महत्वपूर्ण प्रसार के बाद.

चित्रा 1 प्रतिनिधि aAPC मानव सीटीएल के आधार पर पूर्व vivo विस्तार के allogeneic HSCT में दत्तक immunotherapy के लिए प्रवाह चार्ट.

चित्रा 2. सीएमवी विशिष्ट संस्कृति के एक सप्ताह के बाद aAPC द्वारा उत्पन्न सीटीएल के प्रतिनिधि tetramer धुंधला परिणाम

चित्रा 3 प्रतिनिधि सीएमवी विशिष्ट aAPC द्वारा उत्पन्न सीटीएल के intracellular साइटोकाइन धुंधला परिणाम (सीएमवी विशिष्टता 61% था)

चित्रा 4 M-450 Epoxy मोती के प्रतिनिधि धुंधला परिणाम प्रोटीन विरोधी माउस IgG1 पीई और विरोधी माउस IgG2 FITC के साथ दाग संयुग्मन के बाद

Discussion

aAPC प्रणाली हम यहाँ वर्णन प्रतिजनों की एक किस्म के खिलाफ मानव सीटीएल के पूर्व vivo विस्तार के लिए एक कुशल प्रणाली है. विशेष देखभाल 96 अच्छी तरह से थाली संस्कृति में प्रोटीन संयुग्मन की गुणवत्ता और aAPC और सीटीएल का भी वितरण संबंध के साथ लिया जाना चाहिए. हम सीटीएल का विस्तार करने में सक्षम से अधिक 8 सप्ताह के लिए किया गया है, जिसके दौरान हम प्रतिजन विशेष सीटीएल विस्तार एक ^लाख चार गुना करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग . विभिन्न कृत्रिम APC सिस्टम सेल लाइनों या अन्य अकोशिकीय प्लेटफार्मों ⁵ का उपयोग किया गया है, लेकिन प्रकाशित डेटा हर प्रणाली अपने विस्तार और विशिष्टता के लिए संबंध में विभिन्न अनुप्रयोगों के समर्थन के साथ एक अद्वितीय प्रोफ़ाइल है के अनुसार. महत्वपूर्ण बात है, के बाद से सीटीएल की गुणवत्ता के रूप में मात्रा के रूप में में महत्वपूर्ण है, सीएमवी विशिष्ट हमारी प्रणाली द्वारा उत्पन्न सीटीएल के polyfunctionality से बेहतर विरोधी वायरल दक्षता प्रदान की उम्मीद कर रहे हैं.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vacutainer tube (contains heparin)	BD Biosciences	367874
Human CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-094-156
Dynabeads M-450 Epoxy	Invitrogen	140.11
Dynal MPC-1 Magnet	Invitrogen	120-01D
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
RPMI medium 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
HLA-A2-Ig dimer X	BD Biosciences	551263
iTAgMHC tetramer (HLA-A2-CMV)-PE	Beckman Coulter Inc.	T20099
Falcon clear 96-well Microtest plate	BD Biosciences	353077
Rat anti-mouse IgG2a-FITC	BD Biosciences	553390
Goat anti-mouse IgG1-PE	Invitrogen	P21129
Human serum type AB	Atlanta Biologicals	S40110
Mouse anti-human CD8a-FITC	Sigma-Aldrich	F0772
Mouse anti-human CD8a-APC	BD Biosciences	340684
Mouse anti-human IFNγ-FITC	BD Biosciences	340449
Mouse anti-human TNFα-PE	BD Biosciences	340512