HLA - IG基于人工抗原提呈细胞可高效体外扩展人类的CTL

Summary

描述一个新的DC抗原特异性T细胞的诱导和扩张的独立方法。基于HLA A2 - Ig的人工抗原提呈细胞（AAPC）加载与HLA - A2限制性肽能够有效地扩大多样化的抗原特异性CTL的。该技术拥有CTL为基础的过继免疫治疗的巨大潜力。

Abstract

CTL的最佳效应功能发挥的关键作用，在调解对各种细胞内感染和癌症的保护。然而，个人可能会出现抑制免疫微环境，在激活的CTL，其自体的抗原提呈细胞可能倾向于tolerize或anergize抗原特异性CTL。因此，虽然仍处于实验阶段，CTL为基础的过继免疫治疗已经发展成为一个很有前途的治疗各种疾病，如癌症和病毒感染。在最初的实验中，前体外扩增巨细胞病毒（巨细胞病毒）特异性CTL已用于免疫功能低下的异基因骨髓移植患者巨细胞病毒感染的治疗。虽然是很常见的危及生命的巨细胞病毒血症，在这些患者中没有接收病人扩大的CTL发展巨细胞病毒有关的疾病，这意味着抗CMV免疫过继转移^的 CTL 1。可喜的成果也被观察到黑色素瘤，并有可能延长向其他类型^的癌症2。

虽然有很多方法体外刺激和扩大人类的CTL，目前的办法是限制的成本和技术的限制。例如，目前的黄金标准是基于使用的自体DC。这就要求每一个病人捐出大量的白细胞，也很昂贵，费力。此外，在体外直流扩大CTL的特性详细透露，这些有唯一不理想的^效应功能3。

这里我们提出一个高效的AAPC体外扩增人类巨细胞病毒特异性CTL过继免疫治疗（图1）为基础的系统。 AAPC作了耦合细胞大小的磁珠与人类HLA - A2免疫球蛋白二聚体和抗CD28mAb ^4。一旦AAPC是，他们可以满载着各种感兴趣的肽，并保持个月的功能。在这份报告中，AAPC加载与巨细胞病毒，PP65（NLVPMVATV）占主导地位的肽。经过培养纯化与AAPC为期一周的健康捐赠者的人类^CD8 + CTL，巨细胞病毒特异性CTL可显着增加的特异性高达98％（图2）和放大10,000倍多。如果需要更多的巨细胞病毒特异性CTL，进一步扩大可轻松实现与AAPC重复刺激。表型和功能分析显示，这些扩大的细胞效应记忆体的表型和TNFα和γ干扰素（图3）大量。

Protocol

1。 HLA - A2 - IG制作，基于AAPC

1. 准备无菌硼酸盐缓冲液
   1. 硼酸在水中溶解，使0.1M。调整pH至7.0。
   2. 通过0.22μm的无菌过滤和储存过滤4 ° C。
2. 准备无菌珠洗涤液
   1. 以956毫升PBS W / O型的镁或钙。
   2. 添加30毫升人AB血清。
   3. 添加EDTA的2MM终浓度。
   4. 0.1gsodium叠氮化物。
   5. 通过0.22μm的无菌过滤和储存过滤4 ° C。
3. 从Invitrogen公司的M - 450环氧珠1毫升股票，约400万珠（珠可以通过血球计数），并放入无菌，螺杆顶部的玻璃小瓶。
4. 把小瓶针对DYNAL磁铁MPC - 1，而珠坚持一侧小瓶，除去吸上清液。一次洗珠，硼酸盐缓冲液1毫升。
5. 为1ml硼酸缓冲液HLA - A2免疫球蛋白二聚体的抗人CD28单克隆抗体（克隆9.3）和20微克和20微克的混合物悬浮珠。
6. 蛋白质珠共轭：上肩的玻璃小瓶和旋转4 ° 24小时。
7. MPC - 1磁铁放置在管，并删除所有的硼酸盐缓冲。
8. 珠用1ml洗涤液洗磁珠两次。
9. 孵育1毫升珠洗涤液珠，旋转4 ° 24小时。由于珠洗涤液中含有人AB血清，它会阻止所有剩余的蛋白结合位点上的珠子。
10. 从玻璃小瓶中取出上清液，用1ml新鲜珠洗涤液取代。

2。 AAPC肽加载，存储的质量控制

1. 〜5 × 10 ⁵珠添加100μL流式细胞仪，流式细胞仪管清洗缓冲和染色加入1μl抗鼠IgG1 - PE（识别的HLA - A2免疫球蛋白的Fc部分）和抗鼠IgG2a - FITC加入1μl（承认抗CD28单克隆抗体的Fc部分）。染色洗涤液的流式细胞仪20分钟后，洗一遍，并宣读染色结果立即用流式细胞仪（图4）。
2. 肽加载到珠：玻璃小瓶用1ml无菌PBS洗两次珠。用1ml无菌PBS重悬，然后加入加入10μl的CMV肽（1mg/ml的）
3. 通过血球计数珠，标签的日期和浓度的小瓶。
4. AAPC使用后至少3天肽的潜伏期在4 ° C，准备允许有足够的时间到HLA - A2免疫球蛋白二聚体肽结合。珠可以被保存在4 ° C，并保持至少6个月的功能。

3。人类的CTL隔离

1. 收集来自健康的HLA - A2阳性捐助10 BD肝素钠真空采血管管〜新鲜的外周血百毫升。使用了21号针头或更大，以防止溶血。
2. 在室温下离心10分钟，在300xg
3. 小心地取出吸顶级的等离子层。血浆可以用来作为补充培养基。
4. 替换用无菌PBS收集的血浆和血液转移到无菌的T75培养瓶或锥形管50毫升。用PBS的血液充分混合，上下吹打起来。
5. 一旦所有的血液收集，准备4个额外的50毫升锥形管和加入聚蔗糖 - 帕确加15毫升。
6. 慢慢地覆盖3035毫升上方聚蔗糖各管血细胞。接口之间的聚蔗糖和血细胞明显。
7. 在500xg离心机在室温下20分钟。打开刹车“关闭”和加速度尽可能低，以保持层与层之间的界面清晰。
8. 使用seriological吸管，小心吸外周血单个核细胞层，并收集到一个新的50ml的锥形管的PBMC中。当所有PBMC的收获添加400xg PBS和自旋30毫升10分钟。丢弃的上清，用PBS30毫升更多的时间来删除所有剩余的聚蔗糖。
9. 通过美天旎人力，CD8 ⁺ T细胞分离试剂盒，根据制造商的协议进行的CD8 ⁺ T细胞的分离。该试剂盒的高度丰富CD8 ⁺细胞（通常> 95％）消耗^CD8 -细胞。
10. CD8 ^{+ T}细胞计数。预期的纯度应大于95％。为了证实这一点使用2 × 10 ⁵细胞和执行CD4/3/8流式细胞仪分析。其余的CTL可以马上使用抗原特异性AAPC刺激，也可以冻结供日后使用。

在体外 AAPC为基础的文化系统4。

1. 准备培养基
   1. 为TF（T细胞生长因子，在实验室^4）2X的培养基：完全RPMI中加5％自体血浆和8％的T细胞生长因子的捐助。
2. 悬浮1万TF 2X培养液中加完全RPMI培养基8毫升8毫升的CTL，加1 × ¹⁰ 6 AAPC，拌匀。
3. 到96 ü底部组织培养板，使用多渠道pipetter板细胞。 （每孔160μL）
4. 培养细胞在37℃，5％的_CO 2 incubater 7天。第4天与80μL/ TF 2X中等饲料细胞。
5. 细胞是准备7天收获。收获后，将细胞对磁铁，并删除旧的AAPC。
6. 抗原特异性，可根据制造商的协议，由四聚体染色。根据我们以前的研究³表型染色和细胞内细胞因子染色。
7. replated提取的干细胞可以在相同条件下与AAPC再次。反复刺激后预计将增加细胞数量和抗原特异性。

5。代表性的成果：

AAPC后HLA A2 - IG和抗CD28的共轭的例子如图4所示。成功的蛋白共轭是显而易见的，由相应的抗体染色的明显转变。虽然外周血中的巨细胞病毒特异性CTL的频率通常是0.5-1％的AAPC介导的刺激单周后，特异性可以达到55 - 93％（图2和3）。抗原特异性CTL的扩张可以是非常不同的捐助者之间的变量，但结果是在同一捐助重现。扩大巨细胞病毒特异性细胞可以推断，数千倍，易制毒化学水平直接体外（数据未显示） 。细胞内细胞因子染色（图3）表明，这些扩大的CTL官能，而不是消耗殆尽，经过长时间的细胞培养和显着增生。

图1代表AAPC基于前人类CTL的体外扩增流在异体造血干细胞移植的过继免疫治疗的图表

图2代表四聚体染色结果AAPC产生一个文化周后巨细胞病毒特异性的CTL

图3。代表AAPC产生的巨细胞病毒特异性的CTL细胞内细胞因子染色结果细胞病毒（CMV特异性为61％ ）

蛋白共轭抗鼠IgG1 - PE和抗鼠IgG2的- FITC染色后的M - 450环氧珠代表染色结果图4。

Discussion

AAPC系统，我们在这里描述的是一个有效率的制度，为人类CTL体外对多种抗原扩张。应特别注意在96孔板文化方面所采取的蛋白共轭的质量和均匀分布AAPC和CTL。使用这种方法我们已经能够扩大的CTL，为8周以上，在此期间，我们扩大抗原特异性CTL百万^倍 4 。有各种人造的APC系统，利用细胞株或其他无细胞^平台 5，但是，根据公布的数据，每个系统都有其独特的外形扩张和特异性方面支持不同的应用。更重要的是，自CTL的质量和数量的重要，我们的系统所产生的巨细胞病毒特异性CTL polyfunctionality预计赋予优异的抗病毒的效率。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vacutainer tube (contains heparin)	BD Biosciences	367874
Human CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-094-156
Dynabeads M-450 Epoxy	Invitrogen	140.11
Dynal MPC-1 Magnet	Invitrogen	120-01D
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
RPMI medium 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
HLA-A2-Ig dimer X	BD Biosciences	551263
iTAgMHC tetramer (HLA-A2-CMV)-PE	Beckman Coulter Inc.	T20099
Falcon clear 96-well Microtest plate	BD Biosciences	353077
Rat anti-mouse IgG2a-FITC	BD Biosciences	553390
Goat anti-mouse IgG1-PE	Invitrogen	P21129
Human serum type AB	Atlanta Biologicals	S40110
Mouse anti-human CD8a-FITC	Sigma-Aldrich	F0772
Mouse anti-human CD8a-APC	BD Biosciences	340684
Mouse anti-human IFNγ-FITC	BD Biosciences	340449
Mouse anti-human TNFα-PE	BD Biosciences	340512