HLA-Ig Based Artificial antigeen presenterende cellen voor efficiënte Ex vivo Uitbreiding van de Mens CTL

Summary

Een nieuwe DC-onafhankelijke methode voor de inductie en de uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen wordt beschreven. HLA A2-Ig op basis van kunstmatige antigeen presenterende cellen (aAPC) zijn geladen met HLA-A2 beperkt peptiden om efficiënt uit te breiden CTL van diverse antigen specificiteit. Deze technologie biedt veel mogelijkheden voor CTL-op basis van adoptieve immunotherapie.

Abstract

CTL met optimale effectorfunctie spelen cruciale rol in het mediëren van bescherming tegen diverse intracellulaire infecties en kanker. Echter, kunnen individuen vertonen onderdrukkende immuun micro-omgeving en, in tegenstelling tot het activeren van CTL, hun autologe antigeen presenterende cellen kan de neiging om tolerize of anergize antigen specifieke CTL. Als gevolg daarvan, hoewel nog steeds in de experimentele fase, heeft CTL-based adoptieve immunotherapie ontwikkeld tot een veelbelovende behandeling voor verschillende ziekten, zoals kanker en virusinfecties worden. In eerste experimenten ex vivo uitgebreid CMV (cytomegalovirus) specifieke CTL zijn gebruikt voor de behandeling van CMV-infectie bij immuungecompromitteerde allogene beenmerg transplantatie patiënten. Hoewel het gebruikelijk om levensbedreigende CMV viremie hebben bij deze patiënten, geen van de patiënten die uitgebreid CTL ontwikkelen CMV gerelateerde ziekte, wat de anti-CMV immuniteit is vastgesteld door de adoptief overgedragen CTL ^1. Veelbelovende resultaten zijn ook waargenomen voor melanoom en kan worden uitgebreid tot andere vormen van kanker ^2.

Hoewel er zijn vele manieren om ex vivo te stimuleren en uit te breiden menselijke CTL, worden de huidige benaderingen beperkt door de kosten en de technische beperkingen. Bijvoorbeeld, is de huidige gouden standaard gebaseerd op het gebruik van autologe DC. Dit vereist elke patiënt om te doneren een aanzienlijk aantal leukocyten en is ook erg duur en bewerkelijk. Bovendien heeft gedetailleerde in vitro karakterisatie van DC uitgebreid CTL bleek dat deze slechts suboptimaal effector functie ³ hebben.

Hier presenteren wij een zeer efficiënte aAPC gebaseerd systeem voor ex vivo expansie van de menselijke CMV specifieke CTL voor adoptieve immunotherapie (figuur 1). De aAPC werden gemaakt door de koppeling van cel-sized magnetische korrels met menselijke HLA-A2-Ig dimeer en anti-CD28mAb ^4. Zodra aAPC zijn gemaakt, kunnen ze worden geladen met verschillende peptiden van belang, en blijven functioneel voor maanden. In dit rapport werden aAPC geladen met een dominante peptide van CMV, pp65 (NLVPMVATV). Na het kweken gezuiverd humaan CD8 ⁺ CTL van een gezonde donor met aAPC voor een week, kan CMV specifieke CTL drastisch worden verhoogd in specificiteit tot 98% (figuur 2) en versterkt meer dan 10.000 keer. Als er meer CMV-specifieke CTL nodig zijn, kan een verdere uitbreiding eenvoudig worden bereikt door repetitieve stimulatie met aAPC. Fenotypische en functionele karakterisatie toont deze geëxpandeerde cellen hebben een effector-geheugen fenotype en maken grote hoeveelheden van zowel TNFa en IFNy (figuur 3).

Protocol

1. Maken, HLA-A2-Ig op basis van aAPC

1. Bereid steriel boraatbuffer
   1. Los boorzuur in water om 0,1 te maken. Stel de pH op 7,0.
   2. Filtreer door een 0.22μm steriele filter en bewaar bij 4 ° C.
2. Bereid steriele Bead Wash buffer
   1. Neem 956ml PBS w / o magnesium of calcium.
   2. Voeg 30ml menselijke AB serum.
   3. Voeg EDTA 2 mM uiteindelijke concentratie.
   4. Voeg 0.1gsodium azide.
   5. Filtreer door een 0,22 um filter steriel en bewaar bij 4 ° C.
3. Neem 1 ml Invitrogen M-450 Epoxy kralen uit voorraad, ongeveer 400 miljoen kralen (kralen kunnen worden geteld door hemocytometer), en in een steriele, schroef top glazen flacon.
4. Zet de flacon tegen een Dynal magneet MPC-1, terwijl de kralen houden aan de zijkant van de flacon, de bovenstaande vloeistof door aspiratie. Een keer wassen kralen met 1 ml boraatbuffer.
5. Resuspendeer kralen in een mengsel van 1 ml boraatbuffer en 20 ug van HLA-A2-Ig dimeer en 20 ug van anti-humaan CD28 mAb (Clone 9.3).
6. Eiwit tot hiel conjugatie: zet de glazen flacon op rotator en draaien bij 4 ° C gedurende 24 uur.
7. Plaats de buis in MPC-1 magneet en verwijder alle boraatbuffer.
8. Twee keer was de korrels met 1 ml Bead Wash buffer.
9. Incubeer de kralen in 1 ml Bead Wash buffer, draai bij 4 ° C gedurende 24 uur. Omdat Bead Wash buffer bevat humaan AB-serum, dan zullen alle resterende eiwit bindingsplaats blok op de kralen.
10. Verwijder het supernatant van glazen flesje, te vervangen door 1 ml verse Bead Wash buffer.

2. Kwaliteitscontrole van aAPC en peptide laden, opslag

1. Voeg ~ 5 × 10 ⁵ kralen om 100μl FACS wasbuffer in FACS buizen, en de vlek met 1μl van anti-muis IgG 1-PE (erkennen dat het Fc deel van HLA-A2-Ig) en 1μl van anti-muis IgG2a-FITC (te herkennen het Fc-gedeelte van de anti-CD28 mAb). Na kleuring voor 20 minuten in FACS wasbuffer, weer wassen en onmiddellijk lees de vlekken resultaat door flowcytometer (figuur 4).
2. Peptide het laden op de parels: twee keer was de parels in de glazen flacon met 1 ml steriel PBS. Resuspendeer met 1 ml steriele PBS en voeg dan 10μl van CMV-peptide (1mg/ml)
3. Tellen de parels van hemocytometer, en het etiket van het flesje met datum en concentratie.
4. aAPC zijn klaar voor gebruik na ten minste 3 dagen peptide incubatie bij 4 ° C, om voldoende tijd van de peptide binding maken op het HLA-A2-Ig dimeer. De kralen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C en blijven functioneel voor minstens zes maanden.

3. Human CTL isolatie

1. Verzamel ~ 100 ml vers perifeer bloed van gezonde HLA-A2 positieve donor in 10 BD natriumheparine Vacutainer buizen. Gebruik een 21-gauge naald of groter om hemolyse te voorkomen.
2. Centrifugeer bij 300xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur
3. Verwijder voorzichtig de bovenste laag plasma door aspiratie. Het plasma kan worden gebruikt als aanvulling voor het kweekmedium.
4. Vervang de verzamelde plasma met steriele PBS en breng het bloed in een steriele T75 cultuur fles of 50 ml conische buizen. Meng de bloed met PBS goed door en neer te pipetteren.
5. Zodra al het bloed is verzameld, voor te bereiden vier extra 50 ml conische buizen en voeg 15 ml van Ficoll-Paque Plus.
6. Langzaam overlay 30-35ml van bloedcellen op de top van de Ficoll van elke buis. Houd de interface tussen de verschillende Ficoll en bloedcellen.
7. Centrifugeer bij 500xg gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Draai de rem "uit" en de versnelling zo laag mogelijk om een ​​duidelijke interface tussen de lagen te behouden.
8. Met behulp van een seriological pipet voorzichtig zuigen de PBMC laag en het verzamelen van de PBMC in een frisse 50ml conische buis. Als alle PBMC worden geoogst toe te voegen 30 ml PBS en spin op 400xg gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant en wassen nog een keer met 30 ml PBS alle overblijvende Ficoll te verwijderen.
9. Ga verder met CD8 ⁺ T-cellen geïsoleerd door gebruik te maken Miltenyi menselijke CD8 ⁺ T-cel-isolatie kit volgens de fabrikant protocol. Deze kit verrijkt zeer voor de CD8 ⁺ cellen (gewoonlijk> 95%) door afbrekende CD8 ^- cellen.
10. Tel de CD8 ⁺ T-cellen. De verwachte zuiverheid moet groter zijn dan 95%. Om dit te gebruiken 2x10 ⁵ cellen te bevestigen en uitvoeren van een CD4/3/8 FACS-analyse. De resterende CTL kan worden meteen gebruikt voor antigeen-specifieke aAPC stimulatie of ze kunnen worden ingevroren voor toekomstig gebruik.

4. In vitro aAPC op basis van cultuur-systeem

1. Bereid kweekmedium
   1. Voor TF (T-cel groeifactor, gemaakt in het lab ⁴⁾ 2X kweekmedium: volledige RPMI-medium plus 5% autoloog plasma donor en 8% T-cel groeifactor.
2. Resuspendeer miljoen CTL in 8 ml van de TF 2X kweekmedium plus 8 ml van de volledige RPMI-medium, voeg 1 × 10 ⁶ aAPC, goed mengen.
3. Gebruik een multi-channel pipetter to plate cellen op 96 en U-bodem weefselkweek platen. (160 ul per putje)
4. Cultuur-cellen in 37 ° C, 5% CO ₂ incubater gedurende 7 dagen. Voeden de cellen op dag 4 met 80 ul / putje TF 2X medium.
5. Cellen zijn klaar om te worden geoogst op dag 7. Na de oogst, plaats de cellen tegen de magneet en verwijder de oude aAPC.
6. Antigen specificiteit kan worden bepaald door tetrameer kleuring volgens protocol van de fabrikant. Fenotype vlekken en intracellulaire cytokine kleuring worden uitgevoerd volgens onze vorige studie ^3.
7. Geoogste cellen kunnen worden opnieuw uitgeplaat met aAPC weer onder dezelfde voorwaarden. Aantal cellen en antigen specificiteit zal naar verwachting toenemen na herhaalde stimulatie.

5. Representatieve resultaten:

Een voorbeeld van aAPC na HLA A2-Ig-en anti-CD28 conjugatie is weergegeven in Figuur 4. Succesvolle eiwit conjugatie is duidelijk door een duidelijke verschuiving van overeenkomstige antilichaam kleuring. Terwijl de frequentie van de CMV specifieke CTL in het perifere bloed is meestal 0,5-1%, na een enkele week van aAPC-gemedieerde stimulatie, kan de specificiteit te bereiken 55 tot 93% (figuur 2 en 3). De uitbreiding van antigeen specifieke CTL kan zeer variabel tussen de verschillende donoren, maar de resultaten reproduceerbaar zijn binnen dezelfde donor. Door extrapolatie, kan de uitbreiding van CMV specifieke cellen duizenden keer worden vergeleken met het niveau direct voorloper ex vivo (gegevens niet getoond). Intracellulaire cytokine kleuring (figuur 3) laat zien dat deze uitgebreid CTL zijn polyfunctioned, in plaats van uitgeput, na een langdurige celcultuur en significante proliferatie.

Figuur 1. Vertegenwoordiger stroomschema van aAPC op basis van ex vivo expansie van menselijke CTL voor adoptieve immunotherapie in allogene HSCT

Figuur 2. Vertegenwoordiger tetrameer kleuren gevolg van CMV specifieke CTL gegenereerd door aAPC na een week van de cultuur

Figuur 3. Vertegenwoordiger van intracellulaire cytokine kleuring gevolg van CMV specifieke CTL gegenereerd door aAPC (CMV specificiteit was 61%)

Figuur 4. Vertegenwoordiger vlekken gevolg van de M-450 Epoxy kralen na het eiwit conjugatie gekleurd met anti-muis IgG 1-PE en anti-muis IgG2-FITC

Discussion

Het aAPC systeem dat we hier beschrijven is een efficiënt systeem voor het ex vivo expansie van de menselijke CTL tegen een verscheidenheid van antigenen. Speciale aandacht moet worden genomen met betrekking tot de kwaliteit van het eiwit conjugatie en de gelijkmatige verdeling van aAPC en CTL in de 96-well plaat cultuur. Met behulp van deze aanpak hebben we in staat om uit te breiden CTL al meer dan 8 weken, waarin we antigeen-specifieke CTL uitgebreid tot een miljoen maal ^4. Er zijn verschillende kunstmatige APC systemen met gebruik van cellijnen of andere acellulair platforms ^5, maar op basis van de gepubliceerde gegevens elk systeem heeft zijn unieke profiel met betrekking tot uitbreiding en specificiteit ondersteunen van verschillende toepassingen. Belangrijk, omdat de kwaliteit van de CTL is even belangrijk als kwantiteit, zijn de polyfunctionality van de CMV-specifieke CTL gegenereerd door ons systeem zal naar verwachting een superieure anti-virale efficiëntie te verlenen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vacutainer tube (contains heparin)	BD Biosciences	367874
Human CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-094-156
Dynabeads M-450 Epoxy	Invitrogen	140.11
Dynal MPC-1 Magnet	Invitrogen	120-01D
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
RPMI medium 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
HLA-A2-Ig dimer X	BD Biosciences	551263
iTAgMHC tetramer (HLA-A2-CMV)-PE	Beckman Coulter Inc.	T20099
Falcon clear 96-well Microtest plate	BD Biosciences	353077
Rat anti-mouse IgG2a-FITC	BD Biosciences	553390
Goat anti-mouse IgG1-PE	Invitrogen	P21129
Human serum type AB	Atlanta Biologicals	S40110
Mouse anti-human CD8a-FITC	Sigma-Aldrich	F0772
Mouse anti-human CD8a-APC	BD Biosciences	340684
Mouse anti-human IFNγ-FITC	BD Biosciences	340449
Mouse anti-human TNFα-PE	BD Biosciences	340512