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Biology

पहचान और माउस Erythroid progenitors के विश्लेषण CD71/TER119 परख फ्लो - cytometric का उपयोग

Published: August 5, 2011 doi: 10.3791/2809
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 1, 1
1Department of Pediatrics and Department of Cancer Biology, University of Massachusetts Medical School
* These authors contributed equally

Summary

प्रवाह cytometric पहचान और भेदभाव मंच विशिष्ट murine erythroid progenitors और हौसले से काटा माउस अस्थि मज्जा, प्लीहा या भ्रूण जिगर में सीधे व्यापारियों, आणविक विश्लेषण के लिए एक तरीका है. परख सेल सतह CD71 मार्करों, Ter119, और सेल के आकार पर निर्भर करता है.

Abstract

erythropoiesis के अध्ययन के लिए समझने के लिए कैसे लाल कोशिकाओं को पहले hematopoietic और erythroid progenitors से गठन कर रहे हैं करना है. विशेष रूप से, लाल कोशिका गठन की दर हार्मोन (ईपीओ) erythropoietin, जिसका संश्लेषण ऊतक hypoxia के द्वारा ट्रिगर द्वारा नियंत्रित किया जाता है. ईपीओ में एक तेजी से वृद्धि में पर्याप्त ऊतक oxygenation परिणाम erythropoietic दर में वृद्धि ड्राइविंग के लिए एक खतरा, एक प्रक्रिया erythropoietic तनाव प्रतिक्रिया के रूप में जाना जाता है. लाल कोशिकाओं परिसंचारी की संख्या में वृद्धि हुई है जिसके परिणामस्वरूप ऊतक ऑक्सीजन वितरण में सुधार. एक कुशल erythropoietic तनाव प्रतिक्रिया इसलिए अस्तित्व और उच्च ऊंचाई, रक्ताल्पता, नकसीर, कीमोथेरेपी या स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण के रूप में शारीरिक और रोग की स्थिति से वसूली के लिए महत्वपूर्ण है.

माउस erythropoiesis और अपने तनाव प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए एक प्रमुख मॉडल है. निश्चित (वयस्क प्रकार) माउस erythropoiesis नवजात तिल्ली में, और वयस्क तिल्ली और अस्थि मज्जा में भ्रूण 12.5 और 15.5 दिनों के बीच भ्रूण जिगर में जगह लेता है. ऊतक में erythroid progenitors की पहचान की शास्त्रीय तरीकों इन कोशिकाओं की क्षमता लाल सेल कालोनियों को जन्म दे जब ईपीओ युक्त अर्द्ध ठोस मीडिया में चढ़ाया पर भरोसा करते हैं. उनके erythroid अग्रदूत संतान रूपात्मक मापदंड के आधार पर पहचाने जाते हैं. न तो इन तरीकों के शास्त्रीय भेदभाव मंच विशेष अध्ययन के लिए आणविक erythroid कोशिकाओं की बड़ी संख्या के लिए उपयोग की अनुमति देते हैं. यहाँ हम पहचान और अध्ययन हौसले से पृथक माउस ऊतक के संदर्भ में सीधे भेदभाव मंच विशिष्ट erythroid progenitors और व्यापारियों, एक प्रवाह cytometric विधि प्रस्तुत करते हैं. परख CD71 सेल सतह मार्कर, Ter119 पर निर्भर करता है, और प्रवाह cytometric 'आगे तितर बितर' पैरामीटर पर है, जो कक्ष आकार के एक समारोह है. CD71/Ter119 परख के उनके vivo में erythropoietic तनाव के जवाब के दौरान erythroid progenitors अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, कम ऑक्सीजन की स्थिति में खून की कमी चूहों या चूहों में रखे. यह भी आनुवंशिक रूप से संशोधित वयस्क चूहों या भ्रूण के ऊतकों में सीधे erythroid progenitors का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्रम में करने के लिए संशोधित erythropoiesis में आणविक मार्ग की विशिष्ट भूमिका का आकलन.

Protocol

1. ऊतकों की कटाई

  1. 2 से 5 मिलीलीटर ठंड धुंधला बफर (फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) में 0.2% BSA और 5mm ग्लूकोज जोड़ी) युक्त ट्यूबों तैयार. बर्फ पर ट्यूब ऊतक फसल पहले रखो.
  2. चुनना उचित अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार चूहों (जैसे सीओ 2 साँस लेना ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पीछा).
  3. EDTA या हेपरिन रक्त संग्रह ट्यूबों में hematocrit के बाद विश्लेषण, जैसे, reticulocyte गिनती या सीबीसी विश्लेषण के लिए हृदय पंचर द्वारा रक्त ड्रा.
  4. हार्वेस्ट प्लीहा और हड्डियों, एक अलग ट्यूब, चरण 1 में तैयार में प्रत्येक माउस से ऊतकों रखने. तिल्ली के लिए आसान पहुँच के बाईं ओर से है. अस्थि मज्जा, एक फसल या दोनों femurs के लिए. बर्फ पर काटा ऊतक रखो.
  5. अगर वांछित, तिल्ली तौलना. एक erythropoietic तनाव प्रतिक्रिया के दौर से गुजर चूहे तिल्ली वजन में एक उल्लेखनीय वृद्धि दिखाने की संभावना है.

2. तिल्ली कोशिकाओं की तैयारी

  1. पूर्व सिक्त 3 मिलीलीटर सिरिंज सवार का प्रयोग, धीरे से एक 40 सुक्ष्ममापी बाँझ सेल झरनी (Fisherbrand सूची 22363547 नंबर या अन्य) के माध्यम से तिल्ली, या तिल्ली का हिस्सा (आदर्श, 0.1 ग्राम या कम, लगभग 10 8 कोशिकाओं के बराबर) को धक्का एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर रखा. इस प्रक्रिया के दौरान ट्यूब बर्फ पर रखें. झरनी के माध्यम से 2 मिलीलीटर धुंधला बफर के एक कुल के साथ कोशिकाओं का धो लें.
  2. धीरे तनावपूर्ण सेल निलंबन विंदुक के लिए किसी भी छोटे clumps को तोड़ने. यदि आवश्यक हो, कोशिकाओं फिर तनाव.
  3. कोशिकाओं को दो बार centrifugation द्वारा धो लें और ठंड के बफर में फिर से निलंबित.
  4. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं को गिन लो. ठेठ पैदावार 1-2 10 8 कोशिकाओं / तिल्ली एक्स हैं. प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए, aliquote नमूना प्रति 1 से 2 मिलियन कोशिकाओं, या तो FACS धुंधला ट्यूबों में (बी.डी. फाल्कन दौर नीचे polystyrene ट्यूबों, 352,008) या U नीचे 96 अच्छी तरह से थाली (बी फाल्कन 353910). नमूना धुंधला मात्रा 200 μl अंतिम सेल एकाग्रता 0.5 से 1 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल या 1-2 x 10 6 कोशिकाओं 200 / μl नमूना.

3. अस्थि - मज्जा की कोशिकाओं की तैयारी

  1. एक संलग्न 26G सुई, पूर्व ठंड धुंधला बफर के साथ भर के साथ 1 या 3 मिलीलीटर सीरिंज तैयार करें.
  2. जांध की हड्डी के लिए के रूप में इतनी जुड़ी हड्डी कल्पना करने के लिए स्पष्ट रूप से मांसपेशियों निकालें.
  3. तेज शल्य कैंची, जांध की हड्डी के दोनों सिरों बंद कटाव, के रूप में के रूप में बंद के हड्डी के छोर तक संभव का उपयोग करना. यह प्रत्येक कटौती के अंत में एक छोटा सा छेद प्रकट चाहिए, अस्थि मज्जा गुहा, जो जांध की हड्डी की लंबाई के माध्यम से चलाता में अग्रणी है.
  4. चरण 1 में पहले से भरे सीरिंज का उपयोग करना, इन छेद के माध्यम से सुई सम्मिलित करते हैं, और धीरे मज्जा बाहर फ्लश छेद के माध्यम से दूसरे छोर पर एक ट्यूब में है.
  5. कोमल pipetting द्वारा प्लावित कोशिकाओं, और तनाव के रूप में ऊपर तिल्ली के लिए 40 सुक्ष्ममापी झरनी (खंड 2.1 देखें) के माध्यम से अलग कर देना.
  6. ठंड धुंधला बफर में centrifugation से कोशिकाओं में दो बार धो
  7. कोशिकाओं की गणना के लिए और के रूप में 2.4 अनुभाग में resuspend. ठेठ पैदावार प्रति फीमर लगभग 10 7 कोशिकाओं रहे हैं.

4. भ्रूण जिगर की कोशिकाओं की तैयारी

  1. समय गर्भवती मादा चूहों को तैयार करने के लिए, शाम को संभोग के लिए चूहों सेट, योनि प्लग के लिए जांच से पहले 10 अगले दिन हूँ, जो दिन पर योनि प्लग का पता चला है 0.5 दिन माना जाता है. पशु चिकित्सा कर्मचारियों के लिए जो इस गर्भवती महिलाओं की पहचान तकनीक के साथ अपरिचित हैं जांचकर्ताओं की सहायता करने में सक्षम हो सकता है. गर्भावस्था भी निगरानी माउस वजन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है.
  2. समय गर्भवती मादा चूहों 12.5 दिनों से 14.5 गर्भावस्था पर मारी गईं हैं. गर्भाशय सींग बर्फ ठंड संस्कृति मध्यम या धुंधला बफर युक्त पेट्री डिश में निकाल रहे हैं.
  3. भ्रूण प्रत्येक गर्भाशय से हटा रहे हैं और भ्रूण जिगर dissected है. एक विदारक माइक्रोस्कोप भ्रूण दिन 12.5 (E12.5) या छोटे के लिए आवश्यक है.
  4. यकृत dissociated यंत्रवत् बफर में pipetting द्वारा किया जा सकता है, और या तो व्यक्तिगत रूप में 96 अच्छी तरह प्लेटें, संसाधित या एक साथ जमा प्रयोगात्मक आवश्यकताओं पर निर्भर करता है,.
  5. E13.5 पर एक भ्रूण जिगर ~ 10 7 कोशिकाओं है. कक्ष दो बार बफर धुंधला में धो रहे हैं और 1-2 एक्स 10 प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए 6 / 200 μl नमूना कोशिकाओं पर resuspended.

5. प्रवाह cytometry के लिए एंटीबॉडी धुंधला

  1. पूर्व मिश्रण धुंधला सभी नमूनों के लिए इस्तेमाल किया जा नियंत्रण नमूने के लिए छोड़कर, निम्नलिखित युक्त एक प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार:
    • ChromePure खरगोश (जैक्सन, 015-000-003) आईजीजी 200μg/ml की अंतिम एकाग्रता के लिए. बोतल पर शेयर एकाग्रता (यह भिन्न हो सकते हैं) की जाँच करें. यह माउस कोशिकाओं में एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉक करने के लिए प्रयोग किया जाता है, वैकल्पिक प्रजाति है कि इस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है माउस आईजीजी या चूहा आईजीजी हैं. प्रजाति पसंद धुंधला प्रोटोकॉल में माध्यमिक प्राथमिक चूहे / माउस / खरगोश एंटीबॉडी, जो मामले में उन प्रजातियों नहीं किया जा सकता है उपयोग के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के संभावित उपस्थिति के द्वारा निर्धारित किया जाता हैअवरुद्ध एंटीबॉडी के रूप में घ. वैकल्पिक रूप से, 5% खरगोश सीरम भी शुद्ध आईजीजी की जगह में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक और विकल्प मोनोक्लोनल एंटीबॉडी या फैब माउस एफसी रिसेप्टर्स पर निर्देशित टुकड़े का उपयोग है. नीचे बुनियादी प्रोटोकॉल किसी माध्यमिक एंटीबॉडी शामिल नहीं है और इसलिए तीन प्रजातियों में से किसी के आईजीजी इस्तेमाल किया जा सकता है.
    • CD71-FITC, पतला 1:200 (शेयर 0.5mg/ml, बी.डी. बायोसाइंसेज, 553,266)
    • Ter119 पीई, 1:200 (शेयर 0.2mg/ml, बी.डी. बायोसाइंसेज, 553,673) पतला
    • कोई अतिरिक्त एंटीबॉडी ब्याज की सतह epitopes पर निर्देशित हो, जैसे एंटीबॉडी फैस या FasL (1,2 देखें) में निर्देशित है. एंटीबॉडी समाधान धीरे मिश्रण द्वारा inverting ट्यूब 2-3 बार.
  2. प्रत्येक कोशिका नमूना पूर्व मिश्रण के 200 μl जोड़ें और धीरे कोशिकाओं फिर से निलंबित.
  3. नियंत्रण सेल के नमूने की तैयारी के रूप में निम्नानुसार है:
    • 'बेदाग': इन कोशिकाओं को धुंधला बफर में छोड़ दिया जाता है और कोशिकाओं की पृष्ठभूमि autofluorescence प्रदान.
    • 'सिंगल' रंग नियंत्रण: एक ऐसी प्रत्येक एंटीबॉडी / प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता रंग नियंत्रण के लिए आवश्यक है. इन नियंत्रणों में कोशिकाओं या तो एक सीधे संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं, या दोनों एक प्राथमिक एंटीबॉडी और एक संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ. ये नियंत्रण करने के लिए चैनलों के बीच वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए सही करने के लिए उपयोग किया जाता है.
    • 'प्रतिदीप्ति शून्य से एक' (FMO) नियंत्रण: एक ऐसी प्रत्येक प्रोटोकॉल में एंटीबॉडी / रंग नियंत्रण के लिए आवश्यक है: कोशिकाओं के लिए छोड़कर सभी रंग / प्रोटोकॉल में एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं / रंग एंटीबॉडी जिसके लिए इस FMO नियंत्रण है. एक खास चैनल के लिए FMO नियंत्रण कि चैनल के लिए सही पृष्ठभूमि प्रदान करता है. यह उसी निर्धारण की गैर विशिष्ट एंटीबॉडी, और परीक्षण एंटीबॉडी (निर्धारण नियंत्रण) के रूप में एक ही प्रतिदीप्ति निशान के साथ संयुग्मित शामिल हो सकते हैं.
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी में सेते हैं और नमूने प्रासंगिक नियंत्रण के लिए 45 1 घंटे के लिए अंधेरे में '(बर्फ बाल्टी पर एल्यूमीनियम पन्नी कवर डाल) बर्फ पर दाग.
  5. ऊष्मायन अंत में, प्रत्येक नमूना ट्यूब और स्पिन धुंधला बफर के 3ml 4 में लगभग 400 XG डिग्री सेल्सियस पर 3 5 से 'के लिए जोड़ने के द्वारा कोशिकाओं धोने 96 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग कर अगर, कोशिकाओं 200 μl की एक मात्रा में तीन बार धो लो.
  6. प्रासंगिक यदि लागू करने के लिए, माध्यमिक एंटीबॉडी दाग. लागू करें और के लिए पहली एंटीबॉडी दाग ​​धो.
  7. प्रासंगिक यदि Annexin वी के साथ एक दाग ऊष्मायन अंत में लागू किया जाता है, निर्माता के निर्देशों के रूप में एक बफर का उपयोग hepes. यह दाग़ कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए लागू किया जाता है, या बर्फ पर 1 घंटे के लिए.
  8. कोशिकाओं रहे हैं समाधान धुंधला युक्त डीएनए एक सेल अभेद्य डाई में प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए फिर से निलंबित कर दिया, मृत कोशिकाओं को बाहर. Propidium आयोडाइड, 7-एमिनो actinomycin डी (7AAD), या DAPI सहित कई डीएनए रंजक उपलब्ध हैं. इन में से विकल्प उपलब्ध चैनलों, चैनलों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी धुंधला लिया दिया, और प्रवाह cytometer पर उपलब्ध चैनलों पर निर्भर करता है. 7AAD बी.डी. बायोसाइंसेज (559,925) से प्राप्त की है और निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया. DAPI धुंधला के लिए, पाउडर से dimethylformamide (DMF) में 1mg/ml के एक शेयर (Roche, # बिल्ली 236276) बनाने के लिए, -20 ° सी में रखने के लिए, और 1:15,000 के लिए बफर धुंधला में 1:10,000 पतला.

6. फ्लो - cytometric छँटाई

  1. कक्ष CD71, Ter119 खिलाफ एंटीबॉडी, वंश मार्करों, और एक व्यवहार्यता प्रवाह cytometric विश्लेषण (5 अनुभाग) के लिए के रूप में वर्णित डाई के साथ लेबल रहे हैं. लेबलिंग के दौरान सेल एकाग्रता 5 से वृद्धि हो सकती है x 10 7 मिलीलीटर /.
  2. वंश मास्टर मिश्रण बनाने के लिए निम्नलिखित एंटीबॉडी के प्रत्येक के एक बराबर मात्रा मिक्स:
    • FITC विरोधी माउस चूहा MWReg30 CD41, बी.डी. Pharmingen 553848
    • FITC CD45R/B220 RA3-6B2 विरोधी माउस, बी.डी. Pharmingen 553087 चूहा
    • FITC हम्सटर विरोधी माउस 145 2C11 CD3e, बी.डी. Pharmingen 553061
    • FITC विरोधी माउस चूहा M1/70 CD11b/Mac-1, बी.डी. Pharmingen 557396
    • FITC विरोधी माउस चूहा Ly - 6G और Ly-6C (जीआर-1) RB6-8C5, बी.डी. Pharmingen 553126
    • 1:80 पर मास्टर मिश्रण का उपयोग करें (यह प्रत्येक व्यक्ति एंटीबॉडी स्टॉक, जो सभी 0.5 मिलीग्राम / एमएल के 1:400 कमजोर पड़ने के बराबर है).
  3. कम दबाव छँटाई की स्थिति और व्यापक नलिका का उपयोग करें. (बी बायोसाइंसेज) Aria के लिए हम 100 μ नोजल, 20 साई दबाव का उपयोग करें.
  4. बफर: पीबीएस संग्रह के साथ 20% भ्रूण गोजातीय सीरम गयी.
  5. सॉर्ट किया गया आबादी के purities की जांच करने के लिए, एक बफर है कि एक व्यवहार्यता डाई शामिल है (7AAD या समान) में प्रत्येक नमूने से एक छोटे से विभाज्य फिर से चलाने.

7. प्रतिनिधि परिणाम:

वयस्क अस्थि मज्जा या तिल्ली के CD71/Ter119 धुंधला चार सबसेट के विकास क्रम को दिखाता है, लेबल ProE EryA, EryB और EryC (चित्र 1) 1. आकृति विज्ञान, इन तेजी से परिपक्व erythroblasts के अनुरूप. चित्रा 1 डेटा विश्लेषण मंच है, जो बहुत छोटी घटना (नाभिक, लाल कोशिकाओं सहित), एकत्रित कोशिकाओं और मृत कोशिकाओं discards में gating अनुक्रम दिखाता है.

सेल सतह प्रोटीन की अभिव्यक्ति इन कैंपेन्स के प्रत्येक के लिए एक साथ मापा जा सकता है Ter119 और CD71 धुंधला के रूप में एक ही समय में प्रासंगिक एंटीबॉडी जोड़कर,. चित्रा 1 मौत रिसेप्टर फैस एक सेल सतह की अभिव्यक्ति का एक उदाहरण दिखाता है. यह माप ईपीओ के साथ इंजेक्शन चूहों में किया गया था, या नियंत्रण चूहों में खारा इंजेक्शन के साथ है. यह स्पष्ट है कि ईपीओ 1 vivo में EryA आबादी में फैस अभिव्यक्ति दबा.

Intracellular प्रोटीन या कोशिका चक्र स्थिति की अभिव्यक्ति भी प्रत्येक सबसेट में कोशिकाओं के लिए मापा जा सकता है. चित्रा 2 प्रतिनिधि हौसले से काटा अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के कोशिका चक्र विश्लेषण दिखाता है. सेल CD71 और Ter119 के साथ सतह धुंधला के अलावा इन मापों की आवश्यकता होती है, निर्धारण और intracellular लेबलिंग (चर्चा अनुभाग देखें) के लिए कोशिकाओं के permeabilization.

भ्रूण जिगर में, गैर erythroid कोशिकाओं पहले लिन 'कोशिकाओं है कि CD41 के लिए नकारात्मक रहे हैं, मैक-1, जीआर-1, B220 और CD3 (चित्रा 3) पर हैं gating द्वारा बाहर रखा. शेष कोशिकाओं को उप - विभाजित 6 सबसेट, S0 S5 में है. भ्रूण जिगर में कोशिकाओं के सटीक पैटर्न भ्रूण उम्र पर निर्भर करता है (चर्चा अनुभाग देखें). E13.5 भ्रूण जिगर में S3 सबसेट के एक प्रतिनिधि कोशिका चक्र विश्लेषण (चित्रा 4) दिखाया गया है.

चित्रा 1
चित्रा प्लीहा कोशिकाओं और संसाधित थे Ter119 CD71, और फैस में निर्देशित एंटीबॉडी के साथ लेबल: 1 CD71/Ter119 माउस तिल्ली में erythroid ए Gating रणनीति सबसेट. यह आंकड़ा विश्लेषण निम्नलिखित रणनीति डाटा अधिग्रहण कदम दिखाता है. हिस्टोग्राम मैं सभी अधिग्रहीत की घटनाओं से पता चलता है. विकर्ण फाटक की घटनाओं है कि दोहरी या बड़ा समुच्चय को छोड़कर एकल कक्षों, होने की संभावना है का प्रतिनिधित्व करता है. इस फाटक में कक्ष आगे हिस्टोग्राम द्वितीय में विश्लेषण कर रहे हैं. यहाँ बहुत छोटे घटनाओं, की संभावना नाभिक या मलबे, अपवर्जित कर रहे हैं. gated कोशिकाओं हिस्टोग्राम III, जहां DAPI पॉजिटिव कोशिकाओं, कि झिल्ली पारगम्य apoptotic कोशिकाओं की संभावना है और आगे के विश्लेषण के से बाहर रखा गया है में दिखाया जाता है. हिस्टोग्राम चतुर्थ व्यवहार्य तिल्ली कोशिकाओं के परिणामस्वरूप आबादी से पता चलता है. ProE गेट CD71 उच्च Ter119 मध्यवर्ती कोशिकाओं शामिल है . Ter119 उच्च कोशिकाओं को आगे हिस्टोग्राम में विश्लेषण कर रहे हैं वी. यहाँ CD71 उच्च कोशिकाओं को कम परिपक्व, बड़े 'EryA' erythroblasts (CD71 उच्च Ter119 उच्च FSC उच्च) और छोटे, अधिक परिपक्व 'EryB' erythroblasts (CD71 उच्च Ter119 उच्च FSC कम) में subdivided रहे हैं . सबसे परिपक्व erythroblast सबसेट EryC (CD71 कम Ter119 उच्च FSC कम) है. हिस्टोग्राम छठी EryA सबसेट में विशेष रूप से सेल सतह फैस अभिव्यक्ति, बेसल राज्य में चूहों (नमक के साथ इंजेक्शन), और ईपीओ के एक खुराक के साथ चूहों अंतःक्षिप्त में, दिखाता है. फैस एंटीबॉडी के साथ धुंधला बाहर किया गया था एक साथ CD71/Ter119 धुंधला के साथ बी कोशिकाओं के Cytospin तैयारी संकेत कैंपेन्स के प्रत्येक से हल . कक्ष Giemsa के साथ दाग थे और Diaminobenzidine के साथ, बाद उत्पन्न एक भूरे रंग के हीमोग्लोबिन के साथ दाग. Cytospin डेटा मूल लियू एट अल में प्रकाशित किया गया था. रक्त. 2006 1 जुलाई, 108 (1) :123 33-. 2006 ePub 9 मार्च.

चित्रा 2
चित्रा 2 सेल CD71 माउस अस्थि मज्जा में उच्च Ter119 उच्च erythroblasts के चक्र विश्लेषण चूहे. BrdU साथ intraperitoneally अंतःक्षिप्त थे, और तिल्ली या बोन मैरो 30 से 60 मिनट बाद में काटा गया. कक्ष और तय permeabilized थे और CD71 और Ter119 के लिए दाग जा रहा थे, उनकी नकल डीएनए में BrdU शामिल करने के लिए BrdU पर निर्देशित एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ दाग (निर्धारण permeabilization, और BrdU धुंधला हो जाना प्रोटोकॉल निर्माता अनुदेश के अनुसार किया गया था) इसके अलावा में. BrdU पॉजिटिव कोशिकाओं चक्र के एस चरण में हैं. Interphase कोशिकाओं BrdU नकारात्मक हैं और G1 G2 / या एम चरणों में सुलझाया जा सकता है है, डाई 7AAD डीएनए का उपयोग कर.

चित्रा 3
चित्रा 3 CD71/Ter119 माउस भ्रूण जिगर में erythroid ए Gating रणनीति सबसेट:. भ्रूण जिगर की कोशिकाओं CD71, Ter119 के लिए लेबल रहे थे, और FITC लेबल गैर erythroid वंश मार्करों लिन ('') में निर्देशित एंटीबॉडी के एक कॉकटेल. व्यवहार्य कोशिकाओं (7AAD नकारात्मक) लिन अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया गया, और लिन कोशिकाओं आगे S0 के लिए S5 erythroid सबसेट में subdivided रहे हैं. छोटी, कम परिपक्व erythroblasts, परिपक्व S4/S5 सबसेट में कक्षों की अनुपस्थिति द्वारा दिखाए गए E13 भ्रूण जिगर बना है बी कोशिकाओं के संकेत कैंपेन्स के प्रत्येक से हल Cytospin तैयारी. . कक्ष Giemsa के साथ दाग थे और Diaminobenzidine के साथ, बाद उत्पन्न एक भूरे रंग के हीमोग्लोबिन के साथ दाग. Cytospin डेटा मूल था पीपॉप एट अल में ublished, PLoS 8 बॉय (9): e1000484. doi: 10.1371/journal.pbio.1000484.

चित्रा 4
चित्रा 4 सेल भ्रूण जिगर erythroid सबसेट के चक्र विश्लेषण BrdU के साथ गर्भवती चूहों अंतःक्षिप्त थे, और भ्रूण यकृत 30 से 60 मिनट के बाद काटा गया, तय, permeabilized, और Ter119 CD71, और BrdU के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग . S3 कोशिकाओं के सेल चक्र स्थिति में दिखाया गया है.

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Discussion

प्रवाह - cytometric पद्धति किसी भी सेलुलर समारोह है कि एक प्रतिदीप्ति संयुग्मित विशिष्ट एंटीबॉडी या कोशिका की सतह मार्करों, प्रोटीन अभिव्यक्ति, सेल अस्तित्व, सेल संकेतन का उपयोग phospho विशिष्ट 3 एंटीबॉडी और सेल चक्र स्थिति सहित ligand, के साथ पता लगाया जा सकता है की एक साथ जांच की अनुमति देता है. इन मापों भेदभाव मंच विशिष्ट सबसेट का एक संख्या में से प्रत्येक में हौसले से अलग erythropoietic ऊतक के संदर्भ में किया जा सकता है है. इसलिए इस विधि erythropoietic उत्तेजनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के जवाब में या आनुवंशिक परिवर्तन का एक परिणाम के के रूप में कार्यात्मक और आणविक परिवर्तन के erythropoietic प्रणाली के विभिन्न स्तरों पर मूल्यांकन की अनुमति देता है.

नहीं एंटीबॉडी पार जेट के बिना है, और पार जेट ऊतक विशेष हो सकता है. इसलिए यह सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है, पहले परीक्षण एंटीबॉडी के लिए भी, erythropoietic ऊतक के संदर्भ में उनकी विशिष्टता, या तो एक अशक्त या नीचे दस्तक सेल मॉडल का उपयोग कर.

विशिष्ट erythroid सबसेट से कक्ष शाही सेना या transcriptome विश्लेषण के लिए हल किया जा सकता है. क्रमबद्ध करें प्रयोगों कम छँटाई दबाव और व्यापक नलिका का उपयोग क्रम में कोशिकाओं पर कतरनी तनाव को कम करना चाहिए. हम प्रत्येक छँटाई प्रयोग निम्नलिखित सेल शुद्धता और व्यवहार्यता की जाँच की सिफारिश. ध्यान से, प्रवाह cytometry multiparameter के मामले में प्रत्येक रंग के लिए सही पृष्ठभूमि अपने 'FMO' (5.3 देखें) नियंत्रण, जो autofluorescence, अन्य सभी रंगों से वर्णक्रमीय ओवरलैप के कारण पृष्ठभूमि के अलावा में शामिल है, है. विश्लेषण चरण में, एक सबसेट विशिष्ट 'FMO' के नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा जरूरत है.

Erythroblasts के प्रवाह cytometrically परिभाषित सबसेट के भीतर भेदभाव मंच

प्रवाह - cytometric ProE EryA / / / EryB EryC सबसेट सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति और आगे स्कैटर के मामले में परिभाषित कर रहे हैं. हालांकि यह संभावना है कि इन कैंपेन्स के प्रत्येक लगभग एक ही माउस मॉडल की एक विस्तृत विविधता में रूपात्मक erythroblast भेदभाव चरण से मेल खाती है है, हम जब एक नया माउस मॉडल की जांच इस की पुष्टि की सलाह देते हैं. प्रत्येक प्रवाह cytometrically परिभाषित सबसेट के से कोशिकाओं और हल किया जाना चाहिए cytospin तैयारी erythroblasts के morphological मंचन के लिए जांच.

हालांकि CD71/Ter119 प्रत्येक सबसेट भी इसी तरह का भेदभाव चरण के erythroblasts के होते हैं, वहाँ प्रत्येक सबसेट के भीतर विविधता की एक डिग्री रहता है. CD71/Ter119 विधि के पहले आवेदन में, हम मैं अपने CD71 अभिव्यक्ति पर आधारित चतुर्थ क्षेत्रों में Ter119 + कोशिकाओं को विभाजित . इन क्षेत्रों के बीच सटीक सीमाओं 4 मनमाने ढंग से निर्धारित किया गया है. हम बाद में विश्लेषण करने के लिए आगे तितर बितर पैरामीटर के रूप में सेल आकार जानकारी, कहा. यह हमें प्राकृतिक आबादी 1 आकृति (चित्रा 1) का पालन करके सबसेट में Ter119 उच्च कोशिकाओं के विभाजन के लिए अनुमति दी. इस दृष्टिकोण अधिक समान परिपक्वता की आबादी में और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों में परिणामस्वरूप, और हाल ही में अन्य 5,6,7 जांचकर्ताओं द्वारा अनुकूलित किया गया है. EryA सबसेट उप - विभाजित आगे जा सकता है जहां 7 वांछित हो सकता है. एक समूह 8 CD71 के स्थान पर CD44 का उपयोग का सुझाव दिया. हालांकि CD44 कम जल्दी erythroblast चरणों को हल करने में उपयोगी है, यह अधिक परिशुद्धता के साथ बाद में erythroblast सबसेट हल हो सकती है. इसलिए दोनों मार्करों, प्रयोग किया जा सकता है या वैकल्पिक रूप से, अपनी पसंद के हित के विशिष्ट सबसेट पर निर्भर हो सकता है.

एक वैकल्पिक रणनीति multispectral इमेजिंग का उपयोग ImageStream प्रौद्योगिकी (Amnis निगम, सिएटल, WA) 9 कार्यरत हैं. यह की कोशिकाओं के कई हजारों पर दोनों morphological और प्रवाह cytometric डेटा का एक साथ और तेजी से अधिग्रहण की अनुमति देता है. यह चरण - विशिष्ट erythroblasts के आणविक विश्लेषण करने के लिए सम्मान के साथ 'सोने के मानक' हो, क्योंकि रूपिम मापदंड है जिसके द्वारा भेदभाव चरण में परिभाषित किया गया है सीधे मापा जा सकता है की संभावना है. हालांकि, वर्तमान समय में इस तकनीक का कम व्यापक रूप से पारंपरिक प्रवाह cytometry से उपलब्ध है, और दो खामियों से ग्रस्त है: यह सेल छँटाई की अनुमति नहीं है, और यह प्रवाह cytometric मापदंडों की एक छोटी संख्या के लिए सीमित है.

Intracellular प्रतिजनों

Intracellular प्रोटीन या BrdU की जांच सेल निर्धारण और permeabilization की आवश्यकता है. सटीक निर्धारण और permeabilization प्रक्रिया प्रश्न में intracellular प्रतिजन पर निर्भर करता है. हम निर्धारण प्रक्रिया के दौरान LIVE / मृत fixable मृत दाग प्रकोष्ठ (आण्विक जांच) का उपयोग करें, मृत कोशिकाओं से व्यवहार्य भेद. ध्यान से, डिटर्जेंट के साथ permeabilization आमतौर पर प्रभावों Ter119 संकेत है, जो आंशिक रूप से घुलनशील डिटर्जेंट है. हम कोमल डिटर्जेंट (जैसे बी.डी. बायोसाइंसेज से सैपोनिन आधारित बफर / धोने पर्म ') का उपयोग करके इस कठिनाई को दूर. हम भी Ter119 दोनों से पहले के लिए दाग, और निम्नलिखित, प्रक्रिया और नियतन permeabilization क्रम में Ter119 हस्ताक्षर अनुकूलनएनएएल. वैकल्पिक रूप से, यह संभव है CD71 / Ter119 पहली कैंपेन्स के प्रत्येक से व्यवहार्य कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए, और प्रत्येक सबसेट (जैसे भ्रूण जिगर में कोशिका चक्र विश्लेषण देख) 10 से शुद्ध कोशिकाओं पर निर्धारण और permeabilization अलग ले.

भ्रूण जिगर CD71/Ter119 सबसेट

भ्रूण जिगर में CD71/Ter119 धुंधला पैटर्न भ्रूण 2 साल की उम्र (चित्रा 3) पर निर्भर है. हम 6 सबसेट, 10 S0 के लिए S5 में भ्रूण जिगर की कोशिकाओं प्रतिभाग करना. भ्रूण जिगर में निश्चित erythropoiesis के भ्रूण 11 दिन (E11) पर शुरुआत में, कोशिकाओं S0 कैंपेन्स और S1 में केंद्रित कर रहे हैं और बड़े पैमाने पर erythroid कॉलोनी बनाने कोशिकाओं (CFU - ए) हैं. भ्रूण के विकास के साथ, CFU - ए कोशिकाओं proerythroblasts और परिपक्व erythroblasts में अंतर और धीरे - धीरे S5 (चित्रा 3) S2 सबसेट आबाद.

कैंपेन्स S1 S5 के लिए लगभग पूरी तरह से निश्चित वंश के erythroid कोशिकाओं से बना रहे हैं. / - भ्रूण जिगर ये सबसेट EpoR में अनुपस्थित रहे हैं. भ्रूण जिगर में एक Ter119 + कोशिकाओं की संख्या में छोटे आदिम erythroid (जर्दी थैली) वंश के अनुरूप है . / - - EpoR में इन कोशिकाओं को स्पष्ट कर रहे हैं भ्रूण जिगर, जहां कोई निश्चित वंश erythroblasts उठता है, लेकिन जंगली प्रकार 10 भ्रूण जिगर में फॉर्म E13.5 द्वारा कम से कम 1% Ter119 + कोशिकाओं की.

S0 सबसेट विषम है. E13.5 S0 कोशिकाओं के 70% CFU - ए मंच पर सिर्फ EpoR निर्भरता 10 की शुरुआत से पहले erythroid कोशिकाओं, कर रहे हैं . शेष पहले के रूप में अच्छी तरह के रूप में progenitors अन्य hematopoietic प्रजातियों, मुख्य megakaryocytes और मैक्रोफेज की कोशिकाओं रहे हैं, इन कोशिकाओं को हल किया जा सकता है या gated 10 बाहर (चित्रा 3 ).

Erythroid कैंपेन्स की आवृत्ति में परिवर्तन की व्याख्या

Erythroid सबसेट की आवृत्ति में परिवर्तन की देखभाल के साथ व्याख्या की जानी चाहिए. किसी भी सबसेट में कोशिकाओं की आवृत्ति में परिवर्तन उनके बदल apoptotic दर, कि सबसेट के माध्यम से पारगमन समय बदल, या वैकल्पिक रूप से अन्य सबसेट में कोशिकाओं की संख्या में परिवर्तन के कारण हो सकता है कारण हो सकता है. जल्दी erythroblast कैंपेन्स ProE और EryA की वृद्धि की आवृत्ति के लिए एक आम कारण एकाधिक 1 etiologies के erythropoietic तनाव है . 1960 में इसी तरह के निष्कर्ष के दौरान तनाव प्रतिक्रिया 11 erythroblast morphologies का निरीक्षण करके किया गया है उल्लेख किया . तनाव के दौरान पहले व्यापारियों के रिश्तेदार आवृत्ति में वृद्धि के लिए सटीक कारण स्पष्ट नहीं है, लेकिन भाग में तनाव के दौरान 1 इन व्यापारियों के बेहतर अस्तित्व के कारण हो सकता है.

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Disclosures

जानवरों पर प्रयोगों मैसाचुसेट्स मेडिकल स्कूल IACUC समिति विश्वविद्यालय द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.

Acknowledgments

हम UMass प्रवाह cytometry कोर धन्यवाद: रिचर्ड Konz, टेड Giehl, बारबरा Gosselin, Yuehua गुजरात और छलनी Krupoch. यह काम NIH / NHLBI HL084168 RO1 (एमएस) और NIH T32 +१३०८०७ सीए (JRS) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. कोर मधुमेह इन्डोकिरनोलाजी अनुसंधान केंद्र अनुदान DK32520 द्वारा समर्थित संसाधनों का भी इस्तेमाल किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fas-biotin BD Biosciences 554256
Streptavidin-APC Molecular Probes, Life Technologies S868
40 μm sterile cell strainer Fisher Scientific 22363547
Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining BD Biosciences 352008
U-bottom 96 well plate BD Biosciences 353910
ChromePure Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 015-000-003
CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) BD Biosciences 553266
Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) BD Biosciences 553673
7AAD BD Biosciences 559925
DAPI powder Roche Group 236276
FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 BD Biosciences 553848
FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 BD Biosciences 553087
FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 BD Biosciences 557396
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 BD Biosciences 553126
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 BD Biosciences 553061
APC BrdU Flow kit BD Biosciences 557892
Annexin V-biotin BD Biosciences 556418

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References

  1. Liu, Y. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in. 108, 123-133 (2006).
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  3. Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry. J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).
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विकास जीवविज्ञान 54 अंक erythropoiesis hematopoietic progenitors प्रवाह cytometry erythropoietin EpoR / - माउस erythropoietic तनाव भ्रूण erythropoiesis CD71 Ter119 भ्रूण जिगर erythroid सबसेट erythroblast कोशिका चक्र
पहचान और माउस Erythroid progenitors के विश्लेषण CD71/TER119 परख फ्लो - cytometric का उपयोग
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Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay. J. Vis. Exp. (54), e2809, doi:10.3791/2809 (2011).

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