Блок-цитометрии метод для идентификации и молекулярного анализа дифференциации стадии конкретных мышиной предшественников эритроидных и прекурсоров, прямо в только что заготовленных мозга мыши костей, селезенки и печени плода. Анализ основывается на поверхности клеток маркеры CD71, Ter119 и размера ячейки.
Исследования эритропоэза цели понять, как красный клетки образуются из более ранних гемопоэтических и эритроидных предшественников. В частности, скорость образования красных клетка регулирует гормон эритропоэтин (ЭПО), синтез которых вызывается тканевой гипоксии. Угроза на достаточное оксигенации тканей приводит к быстрому увеличению ЭПО, что привело к увеличению эритропоэза случае, процесс, известный как эритропоэтин реакцию на стресс. В результате увеличение количества циркулирующих эритроцитов улучшает доставку кислорода в тканях. Эффективное эритропоэтической стрессовой реакции является поэтому чрезвычайно важным для выживания и восстановления от физиологических и патологических состояний, таких как большой высоте, анемия, кровотечение, химиотерапии или трансплантации стволовых клеток.
Мышь ключевых модель для исследования эритропоэза и его стрессовую реакцию. Мышь окончательного (взрослый тип) эритропоэза происходит в печени плода между эмбриональными дней 12,5 и 15,5, в неонатальном селезенки и во взрослой селезенке и костном мозге. Классические методы определения эритроидных предшественников в ткани полагаются на способность этих клеток вызвать красные колонии клетка при посеве в Epo содержащих полутвердых СМИ. Их эритроидных предшественников потомства опознаются по морфологическим критериям. Ни один из этих классических методов обеспечения доступа к большому числу дифференциации стадии конкретных эритроидных клеток для молекулярных исследований. Здесь мы представляем потока цитометрии метод идентификации и изучения дифференциации стадии конкретных эритроидных предшественников и прекурсоров, непосредственно в контексте свежевыделенных мыши ткани. Анализ основывается на поверхности клеток маркеры CD71, Ter119, а на поток-цитометрии параметр "вперед рассеяния", которая является функцией от размера ячейки. CD71/Ter119 анализ может быть использован для изучения эритроидных предшественников во время их реакции на стресс эритропоэтической в естественных условиях, например, у анемичных мышей или мышей размещалась в условиях низкой кислорода. Он также может быть использован для изучения эритроидных предшественников непосредственно в тканях генетически модифицированных взрослых мышей или эмбрионов, с тем чтобы оценить специфическую роль изменение молекулярный путь в эритропоэза.
Потока цитометрии методология позволяет одновременно расследовании любых клеточных функций, которые могут быть обнаружены с помощью флуоресценции, конъюгированных специфические антитела или лиганд, в том числе на поверхности клеток маркеры, экспрессии белка, выживаемость клеток, к?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим UMass основной проточной цитометрии: Ричард Конц, Тед Giehl, Барбара Госселин, Yuehua Гу и Тэмми Krupoch. Эта работа финансировалась NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) и NIH CA T32-130807 (JRS). Основные ресурсы, поддерживаемые Диабет Эндокринологический научный центр грант DK32520 также были использованы.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Fas-biotin | BD Pharmingen | 554256 |
Streptavidin-APC | Molecular Probes | S868 |
40 μm sterile cell strainer | Fisherbrand | 22363547 |
Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Falcon | 352008 |
U-bottom 96 well plate | BD Falcon | 353910 |
ChromePure Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 |
CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) | BD-Biosciences | 553266 |
Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) | BD-Biosciences | 553673 |
7AAD | BD-Biosciences | 559925 |
DAPI powder | Roche | 236276 |
FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 | BD Pharmingen | 553848 |
FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 | BD Pharmingen | 553087 |
FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 | BD Pharmingen | 557396 |
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 | BD Pharmingen | 553126 |
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 | BD Pharmingen | 553061 |
APC BrdU Flow kit | BD Pharmingen | 557892 |
Annexin V-biotin | BD Pharmingen | 556418 |