Summary
レンチウイルスは、遺伝子機能を探索するための貴重な研究ツールですが、研究者は、既知または疑われる癌遺伝子をコードしてパントロピックレンチウイルスの産生を回避する場合があります。別の方法として、我々はエコトロピック受容体mSlc7a1を表現するように修正ヒト細胞でのエコトロピックレンチウイルスの使用のためのより安全なプロトコルを提示する。
Abstract
幹と腫瘍細胞生物学の研究は、多くの場合、検査技師のための主要な安全性の問題を上げる、もしくはそれが疑われる癌遺伝子とヒト細胞のウイルスの伝達を必要とする。彼らは非分裂細胞を含む多くの細胞型を、形質導入できるため、そのような一般的に使用されるVSV - Gシューのようなパントロピックレンチウイルスは、遺伝子機能を研究するための貴重なツールです。しかし、研究者は、より高い生物学的安全性レベルの処理要件と安全性の問題に起因する癌遺伝子をエンコードするパントロピックウイルスの生産と遠心分離を回避する場合があります。 c - MycおよびSV40ラージT抗原を含むいくつかの強力な癌遺伝子は、誘導多能性幹細胞（IPSC）の生産を高めることが知られている。他のすべての既知のIPSC誘導遺伝的変化（OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、LIN28、および機能のp53の損失）も癌へのリンクを持っている、だけでなく、比較的高い安全性の懸念から、それらを作る。
これらの癌に関連したウイルスが細胞のリプログラミングと多能性を研究する上で有用であるが、それらが安全に使用する必要があります。これらの生物学的安全性の問題に対処するために、我々は、コスト削減と簡便な操作で追加の重点を置いて、エコトロピックレンチウイルスによるヒト細胞の形質導入のための方法を示しています。我々は、受容体発現ヒト細胞は、このアプローチの有効性を検証、ウイルスに暴露の90％以上を形質導入する十分に高い力価を持つエコトロピックレンチウイルスを生産している。
レンチウイルスは、多くの場合、超遠心分離によって濃縮されますが、このプロセスには数時間かかりますし、人間の生物医学研究者への感染性エアロゾルを生成することができます。別の方法として、ウイルス粒子は、より安全にコンドロイチン硫酸とポリブレン（CS / PB）との複合体によって細胞上に沈降することができます。この手法は、安定的に無視できる追加の時間とコストで、マウスレトロウイルス受容体を発現する細胞で3倍にする機能的なウイルスの力価を増加させる。ヒト皮膚線維芽細胞（HDFS）の形質導入は、最大限そのポリマー濃度は、目的の標的細胞のタイプのために滴定する必要が示唆し、以前に癌細胞株で報告された最適値に比べ約4倍低いCS / PB濃度を用いて強化されています。そこで、新たな細胞タイプにおけるポリマーの毒性のアッセイにmethylthiazolyldiphenyl -テトラゾリウムブロマイド（MTT）の使用について説明します。私たちは、最小限の急性毒性を示す、ポリマーの錯体形成またはポリブレン（PB、6μg/ ml）での標準用量のいずれかを使用してウイルスの導入後HDFSの同等の生存率を観察。
このプロトコルでは、我々は生物学的安全性のリスクを低減し、伝達率を増加させる、ヒト細胞における癌遺伝子の過剰発現のためのエコトロピックレンチウイルスの使用を説明します。我々はまた、ウイルス粒子のエアロゾル形成遠心分離を回避しながら、伝達を強化するためにポリマーの錯体化の使用を示します。
Discussion
モロニーマウス白血病ウイルス（MLV）とその受容体のmSlc7a1に基づいて組換えエコトロピックgammaretrovirusよく研究し、広く利用されていますが、マウス細胞に導入遺伝子を提供するために20年以上に渡って使用されたこと。エコトロピックgammaretrovirusは、ヒトの細胞に癌遺伝子を提供するために最近でも使用されています。細胞のリプログラミングの文脈で、人間の癌遺伝子を保有する両種性ウイルスの発生を避けるためにmSlc7a1の使用は十分に確立されている4,5しかし、レンチウイルスはgammaretrovirus上の大きな利点を提供します。レンチウイルスプレインテグレーション複合体ができるため、難治性の細胞集団、多くの場合、再プログラミングのための望ましい目標である6を含む主要な細胞を、形質導入における非分裂細胞の伝達7
レンチウイルスは、ウイルスのトロピズム、毒性、およびその他のプロパティ8 MLV -シュードエコトロピックのレンチウイルスはマウス細胞、9を形質導入するために使用されているが、ほとんどヒト細胞で使用されていないを変更するためにMLVを含むさまざまな疑似型の数十、、で生産されている。10そこで、ヒトの細胞に細胞の初期化因子を含む、既知または疑われる癌遺伝子を、提供するために、安全で効果的なコスト、および高効率車両としてMLV -シュードエコトロピックレンチウイルスの使用を提案する。
それは、このプロトコルが完全にパントロピックレンチウイルスを生成して使用する必要性を排除しないことに注意することは重要であり、むしろ、このプロトコルは、癌に関連したウイルスで自己接種可能性から研究者を絶縁、パントロピックウイルスからがん遺伝子（s）を分離。タンパク質のmSlc7a1とそのヒト相同体のhSlc7a1は遍在11はアンフォトロピックウイルスに組み込むための比較的低リスクのmSlc7a1を作る、知られている腫瘍形成またはレシピエント細胞の選択的な増殖優位性を付与する能力がないとアミノ酸トランスポーターを発現している。この追加ステップは、必要な生物学的安全性レベルの専用のウイルスまたは組織培養施設を欠いている研究室で特に有用である。
いくつかの状況でそれは完全に直接標的細胞へのプラスミドSlc7a1をトランスフェクトすることによりパントロピックウイルスの使用を排除することも可能ですが、この技術の有用なターゲットとなる多くの細胞はまた、トランスフェクションに難治性です。別の方法として、ブラストサイジン選択して細胞をSlc7a1 -形質分離する能力は、VSV - Gシュードタイプレンチウイルスはエコトロピックウイルスが多数のため、これらの細胞を形質導入する日常的に使用することができる後に受容体発現細胞のストックを生成するために一度だけ使用できることを意味します実験。研究者は関係なく、常にその親和性は、任意のレンチウイルスを操作するためのそれらの機関の安全ガイドラインに従ってください。
このプロトコルで実現さエコトロピックウイルスの力価は、以前の研究と一致で、一般的にVSV -偽型ウイルス、パントロピックウイルスの力価の10-20％、より適度に低くなる。9これらの力価が安定してSlc7a1で形質導入ヒト細胞で測定したので、下エコトロピックウイルスのための観察力価は、標的細胞の受容体遺伝子の多様な発現に部分的に原因である可能性があります。それにもかかわらず、我々のプロトコルに到達ウイルス力価は、いくつかのケースでは、ほとんどのアプリケーションにとっては十分以上であり、細胞の大部分の伝達につながる>細胞の90％。
遠心分離ベースの手法は一般的にウイルス粒子を濃縮するために使用されます。しかしながら、遠心分離は、数時間を必要とする感染性エアロゾルを生成し、ウイルス粒子の大幅な損失につながることができる。12を別の方法として、CS / PBとの複合体がウイルス親和性を変化させることなく伝達を強化するために使用することができる。3このメソッドは急速である（5分ほぼ観測された力価を3倍にしながら、（10 mlのウイルス当たり0.03ドル））と安価。特別な機器や独自の試薬 は不要、と我々は他の細胞株での前作との契約で、CS / PBにHDFSの曝露後に最小の急性毒性を観察している。このプロトコルの13つの潜在的な欠点がいくつか微視的に見えるポリマーの複合体が付着することです。文化の中で数日間のための細胞。我々は、これらの複合体は、細胞への公然と毒性はないが、細胞のプロセスで、より微妙な影響を与えることがあるという可能性を排除できない。
ここでは、安全かつ効率的に発癌因子とヒトの細胞を形質導入するための方法論を記載している。このアプローチでは、iPS細胞を含む癌遺伝子と幹細胞生物学を研究に大変有用であるはず。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
このプロジェクトの資金は、再生医療のためのカリフォルニア工科大学によって提供した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pLenti6/UbC/mSlc7a1 | Addgene | 17224 | Murine MLV receptor |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | VSV-G envelope |
| pCMV-dR8.91 | Addgene | D. Trono lab14
Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260) |
|
| pHCMV-Ec–nv | Addgene | 15802 | Ecotropic envelope |
| FUGW | Addgene | 14883 | GFP control plasmid |
| OptiMEM | Invitrogen | 31985 | |
| Fugene HD | Roche Group | 04 709 705 001 | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Blasticidin S | Fisher Scientific | BP 2647100 | |
| Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 |
References
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