Summary
Los lentivirus son una valiosa herramienta de investigación para explorar la función del gen, sin embargo, los investigadores desean evitar la producción de la codificación de lentivirus pantropic conocidos o sospechosos oncogenes. Como alternativa, se presenta un protocolo más seguro para el uso de lentivirus ecotropic en las células humanas modificadas para expresar el receptor mSlc7a1 ecotropic.
Abstract
Madre y el tumor de estudios de la biología celular a menudo requieren la transducción viral de las células humanas con oncogenes conocidos o sospechosos, que planteaba cuestiones importantes de seguridad para el personal de laboratorio. Lentivirus Pantropic, tales como el uso común VSV-G pseudotipo, son una herramienta valiosa para estudiar la función génica, ya que pueden transducir muchos tipos de células, incluyendo las células no se dividen. Sin embargo, los investigadores desean evitar la producción y la centrifugación de los virus pantropic codificación oncogenes debido a los mayores requerimientos de manejo de nivel de bioseguridad y seguridad. Varios oncogenes potentes, incluyendo c-Myc y SV40 antígeno T grande, son conocidos por aumentar la producción de células madre pluripotentes inducidas (IPSC). Todas las otras iPSC que induce cambios genéticos (Oct4, Sox2, Klf4, NANOG, LIN28, y la pérdida de la función de p53) también tienen enlaces con el cáncer, lo que los problemas de seguridad relativamente alto, así.
Aunque estos virus relacionados con el cáncer son útiles en el estudio de la reprogramación celular y pluripotencia, deben utilizarse de manera segura. Para abordar estas cuestiones de bioseguridad, se demuestra un método para la transducción de células humanas con lentivirus ecotropic, con énfasis adicional en el costo reducido y fácil manejo. Hemos producido lentivirus ecotropic con título suficientemente alto como para la transducción de más del 90% de los receptores de las células que expresan humanos expuestos al virus, la validación de la eficacia de este enfoque.
Lentivirus se concentra a menudo por ultracentrifugación, sin embargo, este proceso dura varias horas y puede producir aerosoles infecciosos para la salud humana de los investigadores biomédicos. Como una alternativa de partículas, viral puede ser más segura sedimentado en las células por la formación de complejos con sulfato de condroitina y polibreno (CS / PB). Esta técnica aumenta el título viral funcional hasta 3 veces en células que expresan establemente receptores retrovirus murino, con el tiempo añadido y el coste insignificante. Transducción de los fibroblastos dérmicos humanos (HDFs) es la máxima mejorada utilizando CS / PB concentraciones aproximadamente cuatro veces menor que el valor óptimo se ha informado de líneas celulares de cáncer, lo que sugiere que la concentración de polímero se debe ajustar para el tipo de célula diana de interés. Por lo tanto, describen el uso de methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio (MTT) para el ensayo de toxicidad de polímero en un nuevo tipo de células. Se observa la viabilidad equivalente de HDFs después de la transducción viral utilizando complejos polímero o la dosis estándar de polibreno (PB, 6 mg / ml), lo que indica un mínimo de toxicidad aguda.
En este protocolo, se describe el uso de lentivirus ecotropic para la sobreexpresión de los oncogenes en las células humanas, lo que reduce los riesgos de bioseguridad y el aumento de la tasa de transducción. También demostrar el uso de complejos de polímeros para mejorar la transducción, evitando la formación de aerosoles centrifugación de las partículas virales.
Discussion
Recombinante gammaretrovirus ecotropic basado en el virus de la leucemia murina Moloney (MLV) y su receptor mSlc7a1 están bien estudiadas y ampliamente disponible, después de haber sido utilizado por más de 20 años para ofrecer los transgenes en las células murinas. Gammaretrovirus ecotropic también se ha utilizado más recientemente para ofrecer oncogenes a las células humanas;. En el marco de la reprogramación celular, el uso de mSlc7a1 para evitar la generación de virus anfotrópico albergar oncogenes humanos está bien establecida 4,5 Sin embargo, lentivirus ofrece ventajas significativas sobre gammaretrovirus en la transducción de las poblaciones de células refractarias, 6 incluidas las células primarias que a menudo son objetivos deseables para la reprogramación, ya que el lentiviral pre-integración compleja permite la transducción de la no división de las células 7.
Los lentivirus se han producido decenas de pseudotipos diferentes, incluyendo MLV, en un esfuerzo por alterar el tropismo del virus, la toxicidad y otras propiedades. 8-MLV pseudotyped lentivirus ecotropic se ha utilizado para la transducción de células de ratón, 9, pero rara vez se ha utilizado en las células humanas 10. Por tanto, proponemos el uso de MLV pseudotyped lentivirus ecotropic como un vehículo seguro, rentable y altamente eficiente para entregar oncogenes conocidos o sospechosos, incluyendo factores de reprogramación celular, las células humanas.
Es importante notar que este protocolo no se elimina totalmente la necesidad de producir y utilizar lentivirus pantropic, sino que este protocolo se separa del oncogén (s) del virus de la pantropic, el aislamiento de los investigadores del potencial de auto-inoculación con virus relacionados con el cáncer. El mSlc7a1 proteína y su homólogo humano hSlc7a1 se expresó doquier transportadores de aminoácidos sin tumorigenicidad conocido o capacidad de conferir una ventaja selectiva de crecimiento de las células receptoras, 11 mSlc7a1 realización de un riesgo relativamente bajo para su incorporación en anfotrópico virus. Este paso adicional puede ser especialmente útil en los laboratorios carecen de virus dedicados o instalaciones de cultivo de tejidos del nivel de bioseguridad necesarias.
En algunas situaciones puede ser posible eliminar por completo el uso de virus pantropic mediante la transferencia de la Slc7a1 plásmido directamente en las células diana, sin embargo, muchas células que sería útil para los objetivos de esta técnica también son refractarios a la transfección. Como alternativa, la posibilidad de aislar Slc7a1-células transducidas por la selección blasticidin significa que VSV-G lentivirus pseudotyped puede ser usado una vez para generar una acción de los receptores de las células que expresan, tras lo cual puede ser el virus de ecotropic utilizarse de forma rutinaria para la transducción de estas células para muchos experimentos. Los investigadores siempre deben seguir las directrices de seguridad institucional para trabajar con cualquier lentivirus, independientemente de su tropismo.
Los títulos de virus ecotropic logra con este protocolo son ligeramente inferior a la VSV-pseudotyped virus, por lo general el 10-20% de los títulos de virus pantropic, de acuerdo con estudios anteriores. 9 Estos títulos se midieron en las células humanas establemente transducidas con Slc7a1, por lo que el menor título observado para el virus de ecotropic puede deberse en parte a la expresión variadas del gen del receptor en las células diana. Sin embargo, los títulos virales obtenidos en nuestro protocolo es más que suficiente para la mayoría de las aplicaciones y llevar a la transducción de la mayoría de las células, en algunos casos> 90% de las células.
Basado en las técnicas de centrifugación se utilizan para concentrar las partículas virales. Sin embargo, la centrifugación requiere varias horas, genera aerosoles infecciosos, y puede resultar en una pérdida significativa de partículas virales. 12 Como alternativa, la formación de complejos con CS / PB se pueden utilizar para mejorar la transducción, sin alterar el tropismo viral. 3 Este método es rápido (5 minutos ) y de bajo costo ($ 0,03 por el virus de 10 ml), mientras que aproximadamente el triple del título observado. Ningún equipo especial o de los reactivos de esta naturaleza se requiere, y se observó toxicidad aguda mínima después de la exposición de HDFs a CS / PB, de acuerdo con trabajos previos en otras líneas celulares. 13 Un posible inconveniente de este protocolo es que algunos de los complejos polímero visibles al microscopio se adhieren a las células durante varios días en la cultura. No podemos descartar la posibilidad de que estos complejos, aunque no visiblemente tóxicas para las células, pueden tener efectos más sutiles en los procesos celulares.
Aquí hemos descrito una metodología para la seguridad y eficiencia de transducción de células humanas con factores oncogénicos. Este enfoque debe ser de gran utilidad para los investigadores que estudian los oncogenes y la biología de células madre, incluyendo las células iPS.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
La financiación de este proyecto fue proporcionado por el Instituto de Medicina Regenerativa de California.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pLenti6/UbC/mSlc7a1 | Addgene | 17224 | Murine MLV receptor |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | VSV-G envelope |
| pCMV-dR8.91 | Addgene | D. Trono lab14
Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260) |
|
| pHCMV-Ec–nv | Addgene | 15802 | Ecotropic envelope |
| FUGW | Addgene | 14883 | GFP control plasmid |
| OptiMEM | Invitrogen | 31985 | |
| Fugene HD | Roche Group | 04 709 705 001 | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Blasticidin S | Fisher Scientific | BP 2647100 | |
| Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 |
References
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