Summary
Ein
Abstract
Normale Funktion des Gehirns beruht nicht nur auf der Embryonalentwicklung, wenn wichtige Nervenbahnen etabliert sind, sondern auch auf die postnatale Entwicklung bei neuronalen Schaltkreisen gereift und verfeinert. Fehlregulation in diesem Stadium können zu neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen wie Autismus und Schizophrenie 1,2 führen. Viele Gene sind in der pränatalen Gehirn untersucht und festgestellt, von entscheidender Bedeutung für viele Entwicklungsprozesse 3-5. Allerdings ist ihre Funktion in der postnatalen Gehirn weitgehend unbekannt, teils weil ihre Deletion in Mäusen führt oft zu Letalität bei Neugeborenen Entwicklung, teils weil ihre Forderung in der frühen Entwicklung behindert die postnatale Analyse. Um diese Hindernisse zu überwinden, sind floxed Allele dieser Gene derzeit in Mäusen 6 erzeugt. Wenn mit transgenen Allele, die ausdrückliche Cre-Rekombinase in bestimmten Zelltypen, bedingte Löschung erreicht werden, um Genfunktionen in der postnatalen Gehirn studieren können kombiniert werden. Allerdings erfordert diese Methode zusätzliche Allele und zusätzliche Zeit (3-6 Monate), um die Mäuse mit den entsprechenden Genotypen zu erzeugen, wodurch die Expansion der genetischen Analyse, um im großen Maßstab im Gehirn der Maus.
Hier zeigen wir einen komplementären Ansatz, dass viral-Ausdruck Cre verwendet, um diese floxed Allele schnell und systematisch zu untersuchen in der postnatalen Entwicklung des Gehirns. Durch Einspritzen von rekombinanten Adeno-assoziierte Viren (rAAVs) 7,8 Kodierung Cre in der neonatalen Gehirn, sind wir in der Lage, das Gen von Interesse in verschiedenen Regionen des Gehirns zu löschen. Durch die Steuerung der virale Titer und Koexpression ein fluoreszierendes Protein-Marker, können wir gleichzeitig zu erreichen Mosaik Gen-Inaktivierung und spärliche neuronale Kennzeichnung. Diese Methode umgeht die Forderung vieler Gene in der frühen Entwicklung, und erlaubt uns, ihre Zelle selbst eine autonome Funktion in vielen kritischen Prozesse in der postnatalen Entwicklung des Gehirns, einschließlich axonalen und dendritischen Wachstums-Studie, Verzweigungen und Fliesen, sowie Synapsenbildung und Raffinesse. Diese Methode wurde bereits erfolgreich in unserem eigenen Labor (unveröffentlichte Ergebnisse) und andere 8,9 verwendet, und kann auch auf andere Viren, wie Lentivirus 9, sowie die Expression von shRNA oder dominant aktive Proteine 10 verlängert werden. Darüber hinaus durch die Kombination dieser Technik mit der Elektrophysiologie sowie kürzlich entwickelten optischen Imaging-Tools 11, bietet diese Methode eine neue Strategie zu untersuchen, wie genetische Signalwege neuronalen Schaltkreis Entwicklung und Funktion in Mäusen und Ratten beeinflussen.
Protocol
1. Vorbereitung Viren zur Injektion
- rAAVs wurden von den empfohlenen kommerziellen Anbieter erworben, aber sie können auch in der eigenen Labor hergestellt werden (siehe Diskussion unten). Das Virus ist in der Regel bei einem Titer von ~ 1x10 12 Genom Kopien pro Milliliter (GC / ml) hergestellt und kann bei voller Titer verwendet werden, um eine große Anzahl von Zellen zu manipulieren. Alternativ können sie verdünnt, um das gewünschte Maß an spärliche Beschriftung zu erzeugen. Die entsprechende Verdünnung muss vom Anwender bestimmt werden, aber eine 1:10-Verdünnung wird empfohlen, um zu starten.
- Thaw Viren auf Eis unmittelbar vor dem Gebrauch. Übertragen Sie die gewünschten Vorverdünnung Volumen von Virus-Lösung in eine kleine (~ 250μl) PCR-Röhrchen. Verdünnen Sie die Virus-Lösung mit einem geeigneten Volumen sterilen DPBS in einer Gewebekultur Kapuze. Shop verdünnten Virus-Lösung auf Eis, bis es gebraucht wird.
HINWEIS: Abwicklung aller Viren im Einklang mit einem Biosafety-Protokoll von Ihrer Einrichtung genehmigt durchgeführt werden
2. Spritze Be-und Gerätemontage
- Verbinden Sie den Laden Nadel auf das Glas Spritze und ziehen Sie den Virus-Lösung aus der PCR-Röhrchen durch leichtes Ziehen Sie den Kolben. Ziehen Sie den Kolben, bis eine sehr kleine Luftblase in der Spritze sehen kann, das zeigt, dass die gesamte Lösung in die Spritze ist und nicht in den Laden der Nadel. Alternativ kann auch eine kleine Menge des inerten Farbstoffs an der Lösung zugegeben werden, um sichtbar zu machen.
HINWEIS: Eine kleine PCR-Röhrchen sollen die Be-Nadel wird in der Regel nicht lange genug, um den unteren Rand der meisten anderen Rohren zu erreichen verwendet werden. - Entfernen Sie den Laden Nadel und legen Sie die Spritze auf die Spritze Block einer Spritzenpumpe, befestigen Sie sie mit der Spritze Halter.
- Schieben Sie das eine Ende des Binde-Rohr in die Spritze, stecken Sie das andere Ende in den Nadelhalter. Legen Sie die Injektionsnadel in den Nadelhalter. Das Ende der Injektionsnadel sich direkt an das Ende der Binde-Rohr innerhalb des Nadelhalters.
- Drücken Sie langsam den Kolben von Hand auf die Lösung durch die Binde-Rohr schieben. Drücken, bis ein kleiner Tropfen der Lösung sichtbar ist an der Spitze der Injektionsnadel.
- Vorsichtig Position der Kolben neben dem Drücker-Block und sichern Sie ihn mit dem Schieber blockieren Halterung.
- Setzen Sie die Injektion Parameter: Injektionsrate sollte etwa 8μl/min (~ 130nl / s) sein; Injektionsvolumen ist in der Regel 1-2UL; wählen Sie die entsprechende Spritze Durchmesser für die Spritze Größe, die Sie verwenden (siehe die Spritzenpumpe Handbuch für guidelines).
- Stellen Sie die Kochplatte auf ~ 38 ° C und mit einem Papiertuch oder einem anderen dünnen Barriere für die Welpen während der Erholungsphase zu schützen.
3. Injektionsverfahren und pup Erholung
- Bereiten P0 oder P1 Maus Welpen zur Injektion, indem man sie kalt Anästhesie nach einem IACUC genehmigten Protokoll. Feuchten Sie ein paar Papiertücher mit Wasser und auf Eis stellen. Legen Sie die gewünschte Anzahl von Jungtieren (4-5) auf dem Papiertuch (damit sie auch getrennt) und vorsichtig unter das Papier Handtücher über die Welpen, damit sie von feuchten Papiertuch abgedeckt sind. Gently Ort eine kleine Menge crushed ice auf der Oberseite des Papierhandtücher und inkubieren Sie die Welpen für ca. 5 Minuten. Die Welpen können auf Eis gehalten werden bis zu 15 Minuten und wieder fein danach.
- Nach der Welpe ist ausreichend narkotisiert, stellen Sie es auf einem Montageblock (wir verwenden einen Styropor-Block, hält in der Regel 15ml Tuben) und positionieren Sie es für die besten Zugriff auf die Injektionsstelle. Für die Rinde ist es am einfachsten, das Tier platt auf dem Bauch lag, während für das Kleinhirn ist es hilfreich, den Welpen den Kopf über den Rand des Blocks der Lage, einen besseren Zugang zu den hinteren Teil des Schädels bieten. Der Welpe kann anstelle mit einem Band-Aid gesichert werden, falls gewünscht.
- Halten Sie die Welpen den Kopf in ihn mit einer Hand, während die Nadel manuell durch den Schädel an der gewünschten Stelle mit der anderen Hand eingefügt. Es ist hilfreich, ziehen die Haut straff, um es von Bewegung während der Injektion zu verhindern. Für die Rinde ist es sinnvoll, die Injektionen in Bezug auf eine klar definierte anatomische Wahrzeichen, wie die Lambda-Naht des Schädels zu machen, wie dies auch in Zukunft Injektionen helfen werden. Das Kleinhirn kann durch den Schädel als ein dünner Streifen liegende Gewebe direkt kaudal des Colliculus gesehen werden. Die Tiefe, in der die Nadel eingeführt werden sollte variiert leicht zwischen den einzelnen Tieren und Stämme und kann durch vorher festgelegte Markierungen auf der Nadel gemessen werden, jedoch für Kortex und Kleinhirn finden wir, dass in einer Tiefe von ~ 0,5 - 1 mm von der Oberfläche in der Regel geeignet ist. Die Eintauchtiefe für andere Websites sollten experimentell durch den Endverbraucher bestimmt werden.
HINWEIS: Die Nadel sollte leicht durchdringen den Schädel, wenn es nicht tut, NICHT zu hart, da dies das Tier verletzen kann. Positionieren Sie die Nadel und sanft wieder zu versuchen. - Spritzen Sie die Virus-Lösung. Die Injektion wird gestarteted durch Drücken der START-Taste an der Pumpe oder deprimierend ein Fußpedal, je nach dem Vorbild der Injektor verwendet. In Abwesenheit von einem Fußpedal ist es empfehlenswert, eine Kollegin mit Drücken der Taste zu helfen, unnötige Handbewegungen, dass die Injektion beeinflussen können minimiert werden.
- Nach der gewählten Lautstärke injiziert wurde, halten Sie die Nadel im Ort für ein paar Sekunden und dann entfernen Sie vorsichtig die Nadel, indem Sie sie glatt. Achten Sie darauf, den Welpen den Kopf in Position zu halten, um überflüssige Bewegungen zu minimieren. Da die Injektion Ausrüstung gereinigt und zwischen den Experimenten mit Ethanol sterilisiert und die Wunde klein ist, ist die Verwendung von antiseptischen überflüssig.
- Platzieren Sie den Welpen auf der überdachten Heizplatte mit der eingestellten Temperatur bei ~ 38 ° C zu erwärmen für Erholung, in der Regel 5-10 Minuten. Während dieser Zeit können Sie weiterhin Injektion anderen Welpen.
- Nach all der Welpen erholt haben (sollten sie rosa und Bewegung) nehmen einen Teil der Wohnung Bettwäsche und sanft einmassieren die Welpen mit. Bringen Sie den Welpen der Mutter als eine Gruppe.
HINWEIS: Es ist sehr wichtig, um sicherzustellen, dass die Welpen sind warm und ausgesetzt zu Hause Betten vor Rückgabe an die Mutter und sie als Gruppe zurückzukehren. Andernfalls kann die Mutter verletzen oder zu töten die Jungen führen.
4. Reinigung der Geräte
- Nach der Injektion abgeschlossen ist und die Welpen haben ihre Mutter zurückgegeben worden, reinigen Sie die Injektion Setup durch vollständig laden Sie die Spritze mit Aceton oder 70% Ethanol. Spülen Sie die Lösung durch die Injektion Setup mehrmals mit frischen Lösung jeder Zeit. Damit entfernen Sie alle verbleibenden Virus-Lösung und fällt aus. Das Aceton oder Ethanol wird dann verdampft.
HINWEIS: Aceton ist für die Reinigung bevorzugt, aber wenn Ihr Setup nutzt jede Aceton-empfindlichen Bauteilen, wie Cyanacrylat-Klebstoffe, dann 70% Ethanol für diese Schritte. - Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit Bleichmittel und entsorgen Abfälle in einen geeigneten Behälter für biologischen.
5. Analyse
- Sacrifice die Tiere in der gewünschten Zeit mit einem IACUC genehmigt Euthanasie-Methode. Perfusionsfixierung wird empfohlen, in späteren Visualisierung der infizierten Nervenzellen, insbesondere bei erwachsenen Tieren zu helfen.
- Standard-Immunfärbung Verfahren können verwendet werden, um das Fluoreszenzsignal zu verstärken. Kurz gesagt, sind 100 pm schwimmenden Vibratom Abschnitte mit PBS +1% Triton X-100 permeabilisiert und blockiert in PBS +1% Triton X-100 +10% normalem Ziegenserum. Die Profile werden in Blocking-Lösung mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 ° C, durch zusätzliche Wasch-und Blockierung gefolgt inkubiert. Abschnitte werden dann in Blocking-Lösung mit Sekundärantikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, gründlich gewaschen, montiert auf Dias und eingedeckt mit anti-fade Montage Medien. Kryoschnitte kann auch verwendet werden, um markierten Neuronen sichtbar zu machen, aber die endogene Fluoreszenz verloren gehen.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Eine erfolgreiche Injektionsverfahren wird robust Infektion von Neuronen im Bereich der Injektionsstelle ohne erkennbare Gewebeschädigung oder anderen negativen Auswirkungen auf das Tier zu erzeugen. Wie in Abbildung 1 dargestellt, kann die Ausbreitung der Infektion in Cre-Reporter-Mäuse (ROSA26R) 12 mit rAAV8-Cre in verschiedenen anatomischen Stellen injiziert beobachtet werden. Injektionen in bestimmten Regionen, wie Rinde und Colliculus superior, erzeugen typischerweise lokale Infektionen mit minimaler Ausbreitung auf angrenzende Regionen (Abb. 1A-B). Die Nutzung des High-Titer-Virus-Lösung macht Infektion von benachbarten Gebieten, wie dem Hippocampus, desto wahrscheinlicher (Abb. 1A). Injection mit niedrigem Titer-Virus-Lösung führt zu spärlich Infektion, die in der Regel bleibt in der Nähe der Injektionsstelle, wie im Kleinhirn Injektion von rAAV8-Cre in der Mittellinie des ROSA26R Reporter-Mäuse (Abbildung 1C-D) gezeigt. Wir haben Rekombination in ROSA26R Reporter Mäusen innerhalb von 2 Tagen nach der Injektion von rAAV8-Cre, was darauf hindeutet, dass eine Infektion, Rekombination und Expression von Reporter-Gene lassen sich alle relativ schnell erfolgen. Darüber hinaus haben wir erfolgreich diese Technik verwendet, um die Auswirkungen von Gen-Deletion an einem nicht-ROSA Locus mit einem floxed bedingte Allel Studie werden die Ergebnisse, die an anderer Stelle veröffentlicht werden.
Die Anzahl der Zellen infiziert sind, sollten mit dem Titer der injizierten viralen Lösung korrelieren. Zum Beispiel, Einspritzen einer Mischung aus hohen Titer Lösungen aus zwei rAAV8 Viren, die verschiedene fluoreszierende Proteine in das Kleinhirn befällt viele Purkinjezellen, die unterschiedlich beschriftet sind (Abb. 2A). Umgekehrt kann Einspritzen einer geringen Titer-Virus-Lösung in spärlich Infektion bei der Visualisierung einzelner Zellen (Abb. 2B) Beihilfen führen. Fluoreszenzmarkierten Neuronen können direkt in frischen Schnittblumen, lebendes Gewebe (Abb. 2B) beobachtet werden können oder zu Immunfärbung auf die endogene Fluoreszenz-Signale für die spätere Bildaufnahme von wide-field oder Co zu verbessern unterzogen werdennfocal Fluoreszenz-Mikroskopie (Abb. 2A, Abb.. 3A-C). Schließlich ist rAAV8 infizieren kann eine Vielzahl von Neuronen-Typen in der Hirnrinde mit starken Kennzeichnung von feinen Prozesse (Abb. 3A-C).
Abbildung 1: LacZ Färbung im Gehirn von ROSA26R Reporter Mäusen, die mit rAAV8-Cre bei P0 injiziert wurden demonstriert Cre-Aktivität und die Lage der Infektion.
- Weitwinkel-sagittal Ansicht eines P14 Gehirn, die hohe Titer (1x10 12 GC / ml) Injektionen in Kortex und Colliculus superior. Der Einsatz von High-Titer-Virus macht es wahrscheinlicher, dass benachbarte Bereiche auch infiziert werden.
- Sagittalschnitt P14 Kortex mit niedrigeren Titer (1x10 11 GC / ml) injiziert Virus zeigt eine lokale Infektion mit weniger verbreitet.
- Ein wholemount Ansicht eines P28 Kleinhirn an der Mittellinie mit niedrigen Titer (1x10 9 GC / ml)-Virus-Lösung injiziert zeigt, dass die Infektion spärlich ist und bleibt typischerweise in der Nähe der Injektionsstelle.
- Sagittal Ansicht der Mittellinie des Kleinhirns in C). Beachten Sie, dass in der Regel nur Purkinje Zellen durch rAAV8 infiziert sind.
Abbildung 2: Kleinhirn Kennzeichnung durch Injektion mit hohem und niedrigem Titer von rAAV8 Ausdruck fluoreszierende Proteine.
- Ein Sagittalschnitt der P21cerebellum mit einer Mischung aus beiden Viren Ausdruck EGFP (grün) und DsRed (rot) infiziert. Ein hoher Titer Mischung von Viren verwendet wurde, um eine große Anzahl von Purkinje-Zellen zu infizieren.
- Eine Purkinje-Zelle in Live-P14 Kleinhirn von einem sehr niedrigen Titer Virusinfektion abgebildet sofort nach der Sektion.
Abbildung 3: Kortikale Kennzeichnung von rAAV8-DsRed.
Beispiele für die Vielfalt der kortikalen Neuronen-Typen in der koronalen Abschnitte eines P21 Kortex, um P0 rAAV8-DsRed infiziert war.
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Discussion
Das Neugeborenen-viralen Injektion hier vorgestellte Methode bietet einen einfachen und schnellen Weg, um in vivo Mosaiken für das Studium der postnatalen Entwicklung des Gehirns zu erzeugen. Die Methode nutzt floxed Allele, die derzeit verfügbar sind sowie diejenigen, die über den High-Throughput-Gene Targeting Projekt 6 vorgenommen werden. Verglichen mit dem Einsatz von transgenen Expression von Cre, bietet diese Methode einen schnellen Weg, um Genfunktionen in verschiedenen Zelltypen Test, wie Mäuse, die das floxed Allele können direkt für Experimente genutzt werden, und das gesamte Virus Injektion von Anfang bis Ende kann erreicht in weniger als einer Stunde. Darüber hinaus kann die Anzahl der Zellen infiziert einfach durch Veränderung der Titer des Virus, das spärliche Beschriftung einzelner Neuronen ermöglicht gesteuert werden. Obwohl wir beschrieben nur die neuronale Morphologie in der Probe Bilder, kann die Analyse der infizierten Neuronen zu vielen wichtigen Entwicklungsprozessen, einschließlich axonalen und dendritischen Wachstum, Verzweigung und Fliesen, sowie synaptische Entwicklung wie Wirbelsäule Morphogenese erweitert werden.
Die drei wichtigsten Teile des Verfahrens sind die Genauigkeit der Ausrichtung der Injektionsstelle, die Zuverlässigkeit der Injektion Ausrüstung und das Überleben der Jungtiere. Der erste Aspekt - Genauigkeit - wird am besten durch Erfahrung gelernt. Die Zuverlässigkeit der Injektion Ausrüstung bezieht sich auf die Tatsache, dass man muss sicherstellen, gibt es keine Verstopfungen, Undichtigkeiten oder andere Probleme mit dem Gerät vor der Injektion. Schließlich ist das Überleben der Jungtiere in der Regel kein Problem, wenn die Spitzen in Schritt 3.7 genannten befolgt werden.
Eine offensichtliche Modifikation dieses Verfahrens ist es, eine Mischung aus Viren, die verschiedene Gene zu verwenden. Zum Beispiel kann ein Gemisch aus zwei Viren, rAAV-Cre-GFP und rAAV-RFP, injiziert, um ein Mosaik aus dünn bezeichnet knockout (grün) und Kontrolle (rot) Zellen in einem einzigen Tier zu erzeugen. Dies bietet einen deutlichen Vorteil gegenüber traditionellen Gen Knockouts für die Analyse von einzelnen Zellen, so dass es besonders nützlich für die morphologische Analyse von Neuronen mit Wildtyp-oder mutierte Allele in der gleichen Gehirn der Maus. Dies kann auch eine Einschränkung, aber wenn man will, Verhaltensstudien, in denen es notwendig sein kann, eine große Anzahl von Neuronen zu manipulieren, um eine beobachtbare Wirkung durchzuführen. Wir finden, dass wir in der Regel führen Injektionen bis zu postnatalen Alter 3 (P3), aber ab dem Alter von P4 und auf dem Schädel ist oft zu dick, um leicht Punktion mit der Injektionsnadel. Die Dicke des Schädels in einem bestimmten Alter kann von Tier zu Tier unterschiedlich, aber so dieses Thema muss vom Versuchsleiter beurteilt werden.
Neben der Verwendung von fluoreszierenden Proteinen aus der Cre-exprimierenden Virus, viele fluoreszierenden Reporter-Mäuse mit den loxP-STOP-loxP-Allele generiert wurden 13 und kann mit dem floxed Allel integriert werden ausgedrückt. Obwohl auch die neuen Allel fügt die Zeit für den Erhalt der Mäuse mit den entsprechenden Genotypen benötigt, können diese Reporter-Mäuse die gleichzeitige Überwachung Cre Aktivität und Label einzelnen Neuronen.
Aufgrund der selektiven Tropismus rekombinanter rAAVs können verschiedene neuronale Zelltypen in anatomische Regionen durch die Wahl eines bestimmten rAAV Serotyp (Abbildung 1D) gekennzeichnet werden. Die Spezifität kann auch mit verschiedenen Promotoren erreicht werden. Darüber hinaus können auch andere Viren, wie Lentivirus, verwendet werden, um Neuronen 10 zu infizieren. Der Vorteil hierbei ist, dass diese Viren können größere DNA-Inserts tragen, um nicht nur Cre, sondern auch andere genetische Materialien, wie shRNA und dominant aktiven Gene exprimieren. Darüber hinaus kann das Verfahren auch in dem neu entwickelten transgenen Ratten 14, wo bedingt zum Ausdruck Cre-Linien nicht gut etabliert werden. Schließlich, sobald dieser Technik ist im Labor etabliert, kann es weiter mit anderen analytischen Instrumenten, wie z. B. in vivo Zwei-Photonen-Imaging-11 und / oder Elektrophysiologie, um die Funktion jedes einzelnen Gens in neuronalen Schaltkreis Entwicklung und Funktion zu untersuchen. Kombiniert werden
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch einen Zuschuss von RO1 NIH (NINDS) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments, Inc. | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech Laboratories | 632496 | |
| Heating Block | VWR international | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
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