Summary
Abstract
신경 회로가 성숙하고 세련된 때 정상 뇌 기능은 출생 후의 개발뿐만 아니라 주요의 연결 경로가 설정됩니다 배아 발달에 의존하지만. 이 단계에서 Misregulation는 자폐증과 정신 분열증의 1,2로 신경 및 정신 장애가 발생할 수 있습니다. 많은 유전자가 태아 뇌에서 공부하고 많은 발달 과정을 3-5으로 중요한 발견되었습니다. 그러나, 출생 후의 두뇌에서 기능은 생쥐에서 삭제가 자주 신생아 개발 중에 파괴 장면을 보여 주죠에 이르게 일부 있기 때문에, 그리고 초기 개발에 자신의 요구 사항이 출생 후의 분석을 초래할 일부 있기 때문에, 대부분 알 수 있습니다. 이러한 장애물을 극복하려면 유전자의 대립 유전자는 현재 floxed 생쥐 6 생성되고있다. 표현 Cre 호텔 recombinase는 특정 세포 종류에 조건부 삭제는 출생 후의 두뇌에서 유전자 기능을 연구하기 위해 얻을 수있는 유전자 변형 대립 유전자와 결합하는 경우. 그러나,이 방법은이를 마우스 두뇌의 규모에 유전자 분석의 확장을 제한, 추가 대립 유전자 및 여분의 시간 (3-6개월) 적절한 genotypes와 마우스를 생성해야합니다.
여기 우리는 출생 후의 두뇌 개발에 신속하게 그리고 체계적으로 이러한 floxed 대립 유전자 연구를 virally - Cre 호텔 표현을 사용하는 보완 방법을 보여줍니다. 신생아 두뇌에 재조합 adeno - 관련 바이러스 (rAAVs) 7,8 인코딩 Cre 호텔을 주입함으로써, 우리는 두뇌의 다른 지역에 대한 관심의 유전자를 삭제할 수 있습니다. 바이러스 titer를 제어 및 형광 단백질 마커를 coexpressing함으로써, 우리는 동시에 모자이크 유전자 불활 성화 및 스파스의 연결 라벨을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 분기와 기와뿐만 아니라 버렸네 형성 및 개선, 초기 개발에 많은 유전자의 요구를 무시하고, 우리 axonal 및 돌기의 성장을 포함하여 출생 후의 두뇌 개발에 많은 중요한 과정에서 세포 자율 기능을 공부하실 수 있습니다. 이 방법은 우리 자신의 연구실에서 (미발표 결과) 등 8,9에서 성공적으로 사용되었으며, 같은 lentivirus 9뿐만 아니라 shRNA 또는 지배 활성 단백질 10의 표현에 다른 바이러스에 확장될 수 있습니다. 또한, 전기 생리학이 기술을 결합뿐만 아니라 최근에 개발된 광학 이미징 도구 11,이 방법은 유전자 경로가 마우스 및 쥐의 신경 회로 개발과 기능에 영향을 미치는 방법을 연구하기 위해 새로운 전략을 제공합니다.
Protocol
1. 주사 준비 바이러스
- rAAVs은 권장 상업 공급 업체에서 구입한 있었으나, 그들은 또한 (아래 토론을 참조) 자신의 연구실에서 생산 수 있습니다. 바이러스 솔루션은 일반적으로 밀리리터 당 ~ 1x10 12 게놈 사본 (GC / ML)의 titer에서 생산하고 세포의 큰 숫자를 조작하는 전체 titer에서 사용할 수 있습니다. 또는, 그들은 스파스 라벨의 원하는 수준을 생산하는 희석 수 있습니다. 적절한 희석은 사용자에 의해 결정되어야합니다,하지만 1시 10분 희석을 시작하는 것이 좋습니다.
- 사용하기 전에 즉시 얼음에 바이러스를 녹여. 소형 (~ 250μl) PCR 튜브에 바이러스 솔루션의 원하는 미리 희석 볼륨을 전송합니다. 조직 문화 후드의 살균 DPBS의 적절한 볼륨을 사용하여 바이러스 솔루션을 희석. 그것이 필요 때까지 얼음에 희석 바이러스 솔루션을 저장합니다.
참고 : 모든 바이러스의 처리는 기관의 승인을 biosafety 프로토콜에 따라 실시되어야합니다
2. 주사기 로딩 및 장비 조립
- 부드럽게 플런저를 당기는하여 유리 주사기로 로딩 바늘을 연결하여 PCR 튜브에서 바이러스 솔루션을 그립니다. 공기의 매우 작은 기포가 주사기에서 볼 수있을 때까지 플런저를 당겨,이 솔루션의 모든 주사기에 있으며 로딩 바늘에 남아되지 않았음을 나타냅니다. 또는 불활성 염료의 작은 금액이 표시되도록하기 위해 솔루션에 추가할 수 있습니다.
참고 : 작은 PCR 튜브가 로딩 바늘은 일반적으로 대부분의 다른 튜브의 바닥에 도달하는 정도로 그리 길지 않을 것이기로 사용해야합니다. - 로딩 바늘을 제거하고 주사기 리테이너로 확보, 주사기 펌프의 주사기 블록에 주사기를 놓으십시오.
- 부드럽게 주사기로 결합 튜브의 한쪽 끝을 삽입하고, 바늘 홀더에 다른 쪽 끝을 삽입합니다. 바늘 홀더에 주사 바늘을 삽입합니다. 사출 바늘의 끝을 직접 바늘 홀더의 결합 튜브 내부의 끝을 문의하시기 바랍니다.
- 천천히 결합 튜브를 통해 솔루션을 눌러 수동으로 플런저를 우울. 솔루션의 작은 방울이 분사 바늘의 끝에 표시됩니다 때까지 누르십시오.
- 조심스럽게 푸셔 블록 옆에있는 플런저의 위치와 푸셔 블록 브래킷과 장소에 안전.
- 사출 매개 변수를 설정 : 사출 속도는 약 8μl/min (~ 130nl / s)로한다, 주입 부피는 일반적으로 1 - 2ul되며이 (지침에 대한 주사기 펌프 설명서를 참조)를 사용하는 주사기의 크기에 해당하는 주사기의 직경을 선택합니다.
- 열판을 설정 ~ 38 ° C 및 복구 단계에서 새끼를 보호하기 위해 종이 타월이나 얇은 장벽과 커버.
3. 사출 절차와 펍 복구
- IACUC 승인된 프로토콜을 다음과 추위 마취에 쓰는하여 주사 P0 또는 P1 마우스 새끼를 준비합니다. 얼음 물 장소 몇 종이 타올을 저해할. 종이 타월 (그들이 잘 분리 보관)에 새끼의 원하는 숫자 (4-5)를 놓고 그들이 젖은 종이 타월이 적용되도록 부드럽게 새끼 위에 종이 수건을 접어. 부드럽게 종이 타올 위에 얼음 조각의 작은 금액을 넣고 약 5 분 동안 새끼를 부화. 새끼는 최대 15 분 동안 얼음에 보관하고 나중에 잘 복구할 수 있습니다.
- 강아지가 충분히 anesthetized 후 장착 블록에 배치 (우리가 일반적으로 15ml 튜브를 가지고 스티로폼 블록을 사용) 및 사출 사이트에 최고의 접속을 위해 위치. 피질에 대한 그것은 소뇌에 대한 그것은 두개골의 뒤쪽에 더 나은 액세스를 제공하기 위해 블록의 가장자리 이상의 강아지 머리를 위치에 도움이되는 동안, 그 배꼽에있는 동물의 아파트를 마련하기 쉬운 것입니다. 원하는 경우 강아지는 반창고와 장소에 안전하게있을 수 있습니다.
- 바늘이 수동으로 다른 손으로 원하는 사이트의 두개골을 통해 삽입하는 동안 한 손으로 장소에있는 강아지 머리를 잡아. 주입하는 동안 이동에서 그것을 방지하기 위해 피부가 꽉 끌어 도움이 그것입니다. 피질의 경우 이것이 미래의 주사에 도움이되므로, 같은 두개골의 람다 봉합으로 잘 정의된 해부의 랜드마크에 상대적인 주사를 확인하는 데 유용합니다. 소뇌는 조직이 colliculus 직접 꼬리 거짓말 얇은 스트립으로 두개골을 통해 볼 수 있습니다. 바늘을 삽입해야하는 깊이가 각각의 동물과 종자 사이에 약간 차이가 있으며 바늘에 미리 정해진 마커에 의해 gauged 수 있지만 피질과 소뇌에 대해 우리는 ~ 0.5의 깊이 발견 - 표면에서 1mm 일반적으로 적합합니다. 다른 사이트에 대한 삽입 깊이는 최종 사용자에 의해 실험적으로 결정되어야합니다.
참고 : 바늘이 쉽게 두개골을 관통해야한다 그렇지 않으면이 동물을 다칠 수로 너무 세게 누르지 마. 바늘 위치를 조정하고 부드럽게 다시 시도하십시오. - 바이러스 솔루션을 주사. 주입이 시작됩니다펌프에있는 시작 버튼을 누르면하거나 발을 페달을 우울, 인젝터는 사용 압력의 모델에 따라 의해 에드. 발 페달의 부재에서,이 동료는 주사에 영향을 미칠 수 불필요한 손 움직임을 최소화하기 위해 버튼을 누르면 도와하도록 권장합니다.
- 선택한 볼륨이 주입되고 나면, 몇 초 동안 위치에 바늘을 유지하고 부드럽게 원활하게 그것을 슬라이딩하여 바늘을 제거합니다. 관계없는 움직임을 최소화하기 위해 자리에있는 강아지 머리를 잡아주십시오. 사출 장비 세척 및 소독 에탄올과 실험 사이의 상처가 작고 때문에, 살균의 사용은 불필요합니다.
- ~ 38의 온도 설정으로 덮여 열판에 강아지를 놓고 ° C 복구, 일반적으로 50-10분 위해 따뜻하게합니다. 이 시간 동안 다른 새끼를 넣고 계속 사용할 수 있습니다.
- 새끼 모든 회복 후에 (그들은 분홍색과 이동해야합니다) 홈 침구의 일부를 가지고 부드럽게 그것으로 새끼를 문지 르세요. 그룹으로 엄마와 새끼를 반환합니다.
참고 : 새끼가 엄마에게 반환하고 그룹으로 그들을 반환하기 전에 따뜻한 가정 침구에 노출되도록하는 것이 매우 중요합니다. 이렇게하지 않으면 새끼를 손상하거나 죽이는 어머니가 발생할 수 있습니다.
4. 장비 세척
- 주입이 완료되고 새끼가 어미로 반환되었습니다 후, 완전히 아세톤 또는 70 % 에탄올로 주사기를 로딩하여 사출 설정을 청소하십시오. 신선한 솔루션 때마다을 사용하여 사출 설정 여러 번을 통해 솔루션을 플러쉬. 이것은 남아있는 바이러스 솔루션을 제거하고 precipitates 것입니다. 아세톤이나 에탄올 다음 증발됩니다.
참고 : 아세톤이 청소 선호하지만 설치가 같은 cyanoacrylate 접착제 같은 아세톤에 민감한 구성 요소를 사용하는 경우, 다음 단계에 대한 70 % 에탄올을 사용하는 것입니다. - 적절한 생물 학적 용기에 표백제 및 폐기 쓰레기와 작업 공간을 소독.
5. 분석
- IACUC 승인 안락사 방법을 사용하여 원하는 나이에 동물을 희생. 재관류의 고정은 특히 성인 동물에 감염 뉴런, 이후 시각화에 도움을 권장합니다.
- 표준 immunostaining 절차는 형광 신호를 증폭하는 데 사용할 수 있습니다. 간단히, vibratome 섹션을 떠 100 μm의는 PBS 1퍼센트 트리톤 X - 100 permeabilized 및 PBS 1% 트리톤 X - 100 10% 정상 염소 혈청으로 차단됩니다. 제 4에서 하룻밤 일차 항체 ° C, 세탁 및 차단 추가하여 다음과 솔루션을 차단에 incubated 수 있습니다. 섹션은 다음 상온에서 2 시간 동안 차 항체와 솔루션을 차단에 incubated 철저하게 씻어, 슬라이드에 장착 및 안티 페이드 설치 미디어 coverslipped 있습니다. Cryosections도 레이블 뉴런을 시각화하는 데 사용할 수있는, 그러나 내생 형광가 손실되었을 수 있습니다.
6. 대표 결과 :
성공적인 분사 절차없이 관찰할 수있는 조직 손상이나 동물에서 다른 병에 효과와 주입 사이트의 영역에서 뉴런의 강력한 감염을 생산합니다. 그림 1에서 그림과 같이, 감염의 확산은 다양한 해부 사이트에 rAAV8 - Cre 호텔로 주입 Cre 호텔 - 기자 마우스 (ROSA26R) 12 볼 수 있습니다. 이러한 대뇌 피질과 우수한 colliculus과 같은 특정 지역에 주사는 일반적으로 인접 지역 (그림 1A - B)에 최소한의 확산과 지역 감염을 생성합니다. 높은 titer의 바이러스 솔루션의 사용 (그림 1A) 가능성이 더 높습 같은 해마와 같은 인접 지역의 감염을합니다. ROSA26R 기자 마우스 (그림 1C - D)의 정중선에서 rAAV8 - Cre 호텔의 소뇌 주입과 같이 일반적으로, 사출 현장 근처 남아 스파스 감염의 낮은 titer 바이러스 솔루션 결과와 사출. 우리는 기자의 유전자의 감염, 재조합, 그리고 표현식이 모두 상대적으로 빠르게 발생할 수 제안, rAAV8 - Cre 호텔의 주사 후 2 일 이내에 ROSA26R 기자 마우스의 재조합을 관찰했습니다. 또한, 우리가 성공적으로 floxed 조건부 allele를 사용하여 비 로사 로커스에서 유전자 삭제의 효과를 연구하기 위해이 기술을 사용한의 결과가 다른 게시됩니다.
감염된 세포의 숫자는 주입된 바이러스 솔루션의 titer와 상관 관계한다. 예를 들어, 소뇌에 서로 다른 형광 단백질을 표현하는 두 rAAV8 바이러스의 높은 titer 솔루션의 믹스를 주입하는 것은 differentially (그림 2A) 표시 여러 Purkinje 세포를 감염. 반대로, 낮은 titer 바이러스 솔루션을 주입하는 것은 하나의 세포 (그림 2B) 시각에 투입 스파스 감염이 발생할 수 있습니다. 찬란 분류 뉴런은 신선한 컷, 살아있는 조직 (그림 2B)에서 직접 관찰할 수있다 또는 넓은 필드 또는 공동으로 나중에 이미지 수집을위한 내생 형광 신호를 향상시키기 위해 immunostaining를 받게 될 수 있습니다n 초점 형광 현미경 (그림 2A, 그림. 3A - C). 마지막으로, rAAV8 잘 프로세스의 강력한 라벨 (그림 3A - C)와 피질의 신경 세포 유형의 다양한 감염이 가능합니다.
그림 1 : P0에서 rAAV8 - Cre 호텔로 주입되었다 ROSA26R 기자 마우스의 두뇌에 LacZ의 얼룩은 Cre 호텔의 활동과 감염의 위치를 보여줍니다.
- 높은 titer (1x10 12 GC / ML) 피질과 우수한 colliculus로 주사를 보여주는 P14 두뇌의 넓은 분야 화살 볼 수 있습니다. 높은 titer의 바이러스의 사용은 인접 지역도 감염된다는 것이 더 가능성이 있습니다.
- P14 피질의 화살 섹션은 바이러스가 확산 적은 비용으로 현지 감염을 보여줍니다 낮은 titer (1x10 11 GC / ML)로 주입.
- 낮은 titer과 정중선 (1x10 9 GC / ML) 바이러스 솔루션에 주입 P28의 소뇌의 wholemount보기는 감염이 스파스이며 일반적으로 사출 현장 근처에서 유지 보여줍니다.
- C에서 소뇌의 정중선의 화살보기). 일반적으로 전용 Purkinje 세포 rAAV8에 의해 감염됩니다.
그림 2 : 형광 단백질을 표현 rAAV8 높은 낮은 titers와 함께 주입하여 소뇌 라벨.
- EGFP (녹색) 및 DsRed (적색)을 표현하는이 바이러스의 혼합 감염 P21cerebellum의 화살 섹션을 참조하십시오. 바이러스의 높은 titer 믹스는 Purkinje 세포의 다수를 감염하는 데 사용되었다.
- 매우 낮은 titer 바이러스 감염에서 살고 P14 소뇌의 purkinje 세포는 즉시 절개 후 몇 군데.
그림 3 : rAAV8 - DsRed하여 두피 라벨.
P0에서 rAAV8 - DsRed에 의해 감염 P21 피질의 코로나 섹션에서 대뇌 피질의 신경 세포 유형의 다양한 예.
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Discussion
여기에 제시 신생아 바이러스성 주입 방법은 출생 후의 두뇌 개발의 연구에 대한 생체내 모자이크에서 생성하는 간단하고 빠른 방법을 제공합니다. 방법은뿐만 아니라 현재 프로젝트 6 타겟팅 높은 처리량 진을 통해 만들어지고있는 이들 사용할 수 있습니다 floxed 대립 형질을 활용합니다. Cre 호텔의 형질 표현의 사용에 비해이 방법은 floxed 대립 유전자를 가지고 생쥐가 실험에 직접 사용할 수있는 등, 다양한 셀 유형의 유전자 기능을 테스트하는 빠른 방법을 제공하고,에서 전체 바이러스 주입 절차는 완료 시작할 수 있습니다 한 시간 안에 달성. 또한, 감염된 세포의 수를 쉽게 개별 뉴런의 스파스 라벨을 수있는 바이러스의 titer를 변경하여 제어할 수 있습니다. 우리는 샘플 이미지의 연결 형태를 설명하지만, 감염된 뉴런의 분석은 분기와 기와,뿐만 아니라 척추 morphogenesis으로 시냅스 개발, axonal 및 돌기의 성장 등 많은 중요한 발달 과정에 확장하실 수 있습니다.
절차의 세 가지 가장 중요한 부품은 사출 사이트 사출 장비의 신뢰성 및 새끼의 생존을 타겟팅의 정확성입니다. 첫 번째 측면 - 정확도가 - 최고의 경험을 통해 배웠습니다. 사출 장비의 신뢰성 하나 더 나막신, 누출, 또는 사출하기 전에 장비에 다른 문제가 없는지 확인합니다 사실을 말합니다. 3.7 단계에 나와있는 도움말이 뒤에있다면 마지막으로, 새끼의 생존은 일반적으로 문제가되지 않습니다.
이 절차의 명백한 수정 다른 유전자를 표현하는 바이러스의 혼합물을 사용하는 것입니다. 예를 들어, 두 바이러스, rAAV - Cre 호텔 - GFP와 rAAV - RFP의 혼합물은 하나의 동물에 띄엄띄엄 표시 녹아웃 (녹색) 및 제어 (적색) 세포의 모자이크를 생산하기 위해 주입 수 있습니다. 이것은 동일한 마우스의 뇌에 야생 입력하거나 돌연변 대립 유전자와 뉴런의 형태학의 분석이 특히 유용하게 단일 세포의 분석을 위해 전통적인 유전자 knockouts 비해 뚜렷한 장점을 제공합니다. 이것은 또한 제한이있을 수 있지만, 하나 소원이가 관찰 효과를 생산하는 뉴런의 큰 숫자를 조작하는 데 필요한 수있는 행동 연구를 수행하는 경우. 우리는 나이 P4에서 그러나 우리가 일반적으로 출생 후의 3 세 (P3)에 주사를 수행할 수있는 것을 발견하고 두개골에 자주 주입 바늘로 쉽게 펑크가 너무 두꺼운 있습니다. 특정 나이에 두개골의 두께는 동물에서 동물에 따라 다를 수 있지만, 그래서이 문제는 실험자에 의해 평가해야합니다.
Cre 호텔 - 표현 바이러스, loxP - STOP - loxP 대립 유전자 많은 형광 기자 마우스가 13 생성되었으며 floxed allele와 함께 포함될 수 있습니다에서 표현 형광 단백질을 사용하는 이외에. 새로운 allele을 포함하는 것이 적절한 genotypes과 생쥐를위한 필요한 시간을 추가되었지만,이 기자의 마우스는 동시에 Cre 호텔 활동 및 라벨 개별 뉴런을 모니터할 수 있습니다.
때문에 재조합 rAAVs의 선택 tropism의 다른 세포의 연결 유형은 특정 rAAV의 혈청형 (그림 1D)를 선택하여 해부 지역 표시하실 수 있습니다. 특이성은 또한 다른 발기인을 사용하여 얻을 수 있습니다. 또한, 같은 lentivirus 같은 다른 바이러스는, 뉴런 10 감염하는 데 사용할 수 있습니다. 이곳의 장점은 이러한 바이러스가 Cre 호텔뿐 아니라 shRNA와 지배 활성 유전자와 같은 다른 유전 물질뿐만 아니라 표현을 큰 DNA의 삽입을 수행 수있다는 것입니다. 또한, 방법도 조건 표현 Cre 호텔 라인이 잘 구축되지 않은 새로 개발된 유전자 변형 쥐 14에서 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 한때이 기술은 실험실 설립이다, 그것은 더 이상 이러한 생체내에서와 같은 다른 분석 도구를 두 광자 이미징 11 및 / 또는 전기 생리학, 신경 회로 개발 및 기능에서 각 유전자의 기능을 연구하기 위해 서요.와 함께 조합하여 사용할 수
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH (NINDS)에서 RO1 교부금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments, Inc. | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech Laboratories | 632496 | |
| Heating Block | VWR international | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
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